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研究背景目前,开胸手术已被广泛用于治疗各种类型的心脏疾病,体外循环是开胸心脏手术中至关重要的手段。尽管如此,一些研究揭示了这种手术本身能够引起人体多种器官的损伤,其中多数伴随着组织器官的缺血再灌注损伤。因此,研究缺血再灌注损伤的机制,尝试规避或减弱这一临床问题将为患者带来益处。miRNAs是短片段单链非编码RNAs,它能够靶向mRNAs进行转录后调控。不断积累的研究表明了miRNAs在缺血再灌注损伤的发展过程中扮演重要角色,其可能成为治疗心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点。目的：本研究通过尝试了解体外循环的心脏手术过程中一些与心肌有关的miRNAs变化,并对miR-208a这一关键miRNA进行深入研究,利用大鼠缺血再灌注模型检测miR-208a在缺血再灌注损伤中的作用。以期为缺血再灌注的早期诊断、防治提供理论依据,为未来的分子治疗提供潜在靶点。方法：1, qRT-PCR检测15例风心病患者体外循环的开胸手术过程中miR-1/21/208a/499分别在四个时间点的表达水平(术前、主动脉阻断45 mmin后、再灌注60mmin后、术后24h)；检测传统生理生化指标肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白1(cTnI)的水平；通过统计学分析检测它们之间的相关性。2,构建大鼠缺血再灌注模型,将Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham)和缺血再灌注组(I/R),Sham组大鼠仅开胸,I/R组开胸结扎冠状动脉左前降支45min后再灌注120min。荧光定量PCR检测miR-208a的表达变化；Evans蓝染色和氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC)染色来检测心肌梗死情况;HE染色检测心肌组织形态结构变化；末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术(TUNEL)检测各组心肌细胞凋亡情况；Western blot检测心肌细胞凋亡标志物Caspase-3的变化。3,采用antagomir调控miRNA的表达,检测是否能够减缓缺血再灌注损伤：构建大鼠缺血再灌注模型,将大鼠随机分为缺血再灌注组(I/R)、control antagomir注射后再行缺血再灌注组(I/R+anta-control), miR-208a antagomir注射后再行缺血再灌注组(I/R+anta-miR-208a). I/R组开胸结扎前降支45min后再灌注120min。I/R+anta-control或I/R+anta-miR-208a为缺血再灌注前2天注射2nmol剂量的相应antagomir。荧光定量PCR检测miR-208a的表达变化；Evans蓝染色和TCC检测心肌梗死情况；HE染色检测心肌组织形态结果变化；TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况；Western blot检测心肌细胞凋亡标志物Caspase-3的变化。荧光定量PCR检测心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)和脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)的表达水平,同时采用LDH检测试剂盒检测各组大鼠血清LDH水平以评估心肌功能。4,通过生物信息学的方法预测miR-208a的潜在靶向mRNA,通过荧光素酶报告实验初步筛选miR-208a的靶基因,并运用流式细胞术检测转染后各组细胞的凋亡情况。结果：1, miR-1/208a/499的表达在体外循环前和再灌注后出现了明显的变化(P <0.05), miR-21在本研究中未观测到变化(P>0.05)。miR-1/208a的表达水平在主动脉阻断45min时出现显著变化(P<0.05),但当再灌注60min后显著增加(P<0.05),并持续至术后24h(P<0.05)。miR-1/208a的表达变化模式同传统生理指标CK-MB和cTnl的水平变化相似,而且miR-208a的变化较miR-1迅速。与之相反,miR-499的表达水平在再灌注后持续降低一直到术后24h(P<0.05)。而且它的变化同CK-MB和cTnl的水平变化呈负相关。2,通过心电图和染色检测结果表明,大鼠的心脏缺血再灌注损伤模型成功构建。与Sham组相比较,I/R组的大鼠心肌缺血区miR-208a显著升高(P<0.05)；细胞凋亡率明显增加(P<0.05),凋亡标志物Caspase-3表达水平升高(P<0.05),剪切体被激活。这暗示了miR-208a可能与心肌细胞的凋亡存在一定的关联性。3,大鼠转染antagomir后进行缺血再灌注损伤造模,随后进行各项指标的检测。结果发现,I/R+anta-miR-208a组中的miR-208a的表达水平明显低于其余两组(I/R和I/R+anta-control) (P<0.05),表达明显受到抑制。TCC检测结果发现I/R+anta-miR-208a组的心肌梗死范围明显少于其余两组(P<0.05)；TUNEL检测结果显示I/R+anta-miR-208a组的心肌细胞凋亡率显著降低,Caspase-3表达水平也同样显著降低(P<0.05); ANF和BNP以及血清中LDH的水平在anta-miR-208a处理后均显著降低(P<0.05),说明心肌功能障碍有所减轻。各个指标在I/R和I/R+anta-control两组中均无显著性差异(P>0.05)。4,根据生物信息学分析,我们预测miR-208a与GATA4和QKI5的3’UTR区域有直接的结合位点。进一步对之前的样本进行GATA4和QKI5表达水平检测发现,I/R组的GATA4和QKI5表达水平较Sham组显著降低；与I/R组相比,抑制miR-208a预处理能够升高GATA4和QKI5的表达,二者存在负相关性。双荧光素酶报告基因检测证实了miR-208a同GATA4而非QKI5的靶向关系。结论：1,在体外循环的开胸手术过程中,miR-1/208a/499出现了显著变化,其中miR-208a反应更加迅速。2,在大鼠缺血再灌组损伤模型中,降低miR-208a的表达水平能够明显抑制心肌细胞的凋亡,减缓由于缺血再灌注所导致的心肌功能障碍,具有心脏保护作用。3, miR-208a的这种作用可能通过靶向GATA4或影响QK15相关信号通路来实现。