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胃癌(Gastric cancer,GC)是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率占全球癌症发病率的第5位,死亡率则位居2位。胃癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一,分别占男女性癌症发病率的第2位和第3位,死亡率均位于第2位。胃癌的早期诊断与治疗对于改善患者预后具有重要作用,但我国早期胃癌的诊断率不足10%,半数以上的病例发现时已处于Ⅲ、Ⅳ期,出现了局部大血管侵犯或远处转移,即使给予姑息手术联合放化疗治疗,其远期预后也较差,5年生存率不足30%。现有的肿瘤标记物在早期胃癌中变化不明显,仅在部分进展期胃癌中升高,因此迫切需要一种新的胃癌相关生物学标记物,为胃癌的早期诊断和治疗提供指导。micro RNAs(miRNAs)的发现为胃癌的早期诊断提供了新的方向。miRNAs是一类长度在22 nt左右的内源性非编码小RNA,主要通过与Argonaute家族蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),在转录后水平调节m RNA的表达。大量研究显示,miRNAs在调控癌细胞的生长、增殖、分化及凋亡中均发挥着重要作用,并与癌症的侵袭、转移等过程相关。此外,研究显示,在血浆中可检测到稳定表达的miRNAs,这些都为miRNAs应用于胃癌的早期诊断提供了理论基础。目的:筛选胃癌血浆和组织中差异表达的miRNAs,评价其作为生物学标记物对胃癌的诊断价值。方法:收集42例胃癌患者血浆标本、42例年龄和性别匹配的正常对照者血浆标本,23对福尔马林固定、石蜡包埋的胃癌组织及癌旁组织标本。应用solexa测序,在8对胃癌血浆和正常血浆,8对胃癌组织和癌旁组织中初步筛选胃癌差异表达的miRNAs。在复筛阶段,应用q RT-PCR逐步扩大样本进一步验证差异表达的miRNA。然后,应用ROC曲线分析筛选出的miRNAs对胃癌的诊断价值。最后,对胃癌细胞培养基中的miRNAs表达水平进行研究,分析血浆中miRNAs的可能来源。结果:1应用Solexa测序结果胃癌血浆中检测到635种miRNAs的表达,健康对照血浆中检测到634种miRNAs,胃癌组织中检测到1023种miRNAs,癌旁组织中检测到772种miRNAs。其中,血浆中差异表达的miRNAs有146种,组织中差异表达的miRNAs有207种,在血浆和组织中表达一致的miRNAs共有31种。2应用q RT-PCR进一步筛选候选miRNA应用q RT-PCR,在测序标本(8对胃癌血浆和正常血浆,8对胃癌组织和癌旁组织)中对上一阶段筛选出的31种miRNAs的表达水平进行逐一验证,进一步筛选差异表达的miRNAs。结果显示,miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌血浆及组织中的表达都是升高的,用于下一步验证。3扩大样本对5种差异表达的miRNAs进一步验证在42例胃癌血浆和42例正常血浆,23对胃癌组织及癌旁组织中,进一步验证上阶段差异表达的5种miRNAs。结果显示,miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌血浆中的相对表达量(与U6比较,中位数)依次为0.0169、0.0231、0.0282、0.0363、0.0058;在健康对照血浆中的相对表达量依次为:0.0030、0.0101、0.0100、0.0157、0.0032;两组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌组织中的相对表达量(与U6比较,中位数)依次为:14.77、0.63、0.92、0.64、0.16;在癌旁组织中的相对表达量依次为:7.56、0.36、0.58、0.42、0.07;两组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌血浆及组织的表达中均明显升高。4目的miRNA对胃癌的诊断价值为了检测5种miRNA对胃癌的诊断作用,对42例胃癌血浆患者及42例健康对照进行ROC曲线分析。结果显示,单独检测miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p的曲线下面积分别为:0.785(95%CI:0.688~0.882)、0.766(95%CI:0.663~0.869)、0.743(95%CI:0.634~0.851)、0.729(95%CI:0.620,0.838)和0.724(95%CI:0.614~0.833)。联合检测miR-17-5p和miR-127-3p的曲线下面积可达0.810(95%CI:0.720~0.901)。以上结果表明检测这5种miRNAs有助于胃癌的诊断。5目的miRNA对早期胃癌的诊断作用为了解目的miRNA的检测是否有助于早期胃癌的诊断,本研究对健康对照、早期胃癌、进展期胃癌血浆中5种miRNA表达水平进行了对比研究。结果显示,miR-433-3p、miR-654-3p在早期胃癌中未见明显变化(P>0.05),仅在进展期胃癌中可见明显升高(P<0.05)。而miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p的表达水平在早期胃癌中即出现了明显升高(P<0.05),表明这3种miRNAs可能有助于早期胃癌的诊断。6胃癌细胞培养基中5种miRNA表达水平的比较在SGC7901胃癌细胞培养基中,miR-17-5p的表达量随时间延长逐渐升高(P<0.05),而miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p无明显变化(P>0.05)。结果提示血浆miR-17-5p水平升高,可能主要来源于胃癌细胞的分泌。结论:1 miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌血浆和组织中表达升高。2血浆miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p在早期胃癌中即出现了明显升高,并且可获得较大的AUC值,有望成为胃癌早期检测的生物学标志物。3血浆中的miR-17-5p可能来源于胃癌细胞的直接分泌,miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p可能来源于胃癌细胞与其他细胞的相互作用。