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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的肝癌形式,是全球癌症相关死亡的第四大原因。虽然目前肝癌的治疗方法有很多,比如手术切除、肝移植、射频消融、经导管动脉化疗栓塞和酪氨酸激酶抑制剂治疗等,但大多数HCC患者在诊断时已处于中晚期因此治疗措施有限。我国最新版的《原发性肝癌诊疗指南》明确推荐在肝癌的围手术期、术后综合治疗期、姑息期及康复期等不同时期可运用中国中医药（traditional Chinese medicine,TCM）配合西医治疗以控制症状、预防复发转移及延长生存时间。复方斑蝥胶囊（Compound mylabris capsules,CMC）是一种经典中药配方,主要有斑蝥、人参、黄芪、刺五加、三棱、半枝莲、莪术、山茱萸、女贞子、甘草等成分组成。现代药理学研究表明,斑蝥素（斑蝥提取物）和斑蝥素类似物具有抑制肿瘤细胞生长的作用。但由于其严重的副作用,其作为单体药物的临床应用受到限制。与之相对应的是,CMC以其严格的配伍原则和注重整体的理念,被证明在治疗HCC患者中具有良好的临床疗效和低毒性。然而,由于CMC组成的复杂性和研究方法不足,其治疗HCC的作用机理和分子靶点需要进一步的研究。与其他中药配方相似,CMC对HCC的治疗作用可能涉及多组分、多靶点和多途径。网络药理学是进一步揭示中药方剂治疗机制的重要工具,它综合探索药物、靶点和疾病之间的相互关系,直观地展示药物-靶点-疾病的网络。这种方法描述了复杂药物作用的详细机制,符合中医的整体观点。而中医药治疗机制的验证步骤最终需要通过细胞和分子生物学实验进行。以往的研究表明,血清药理学不仅减少了中药原材料药理化性质对实验结果的干扰,而且更接近于天然的体内环境。因此该方法在细胞学实验中研究中医更合适、更科学。本研究结合网络药理学和生物信息学的方法,探讨CMC治疗HCC核心分子靶点。此外,采用血清药理学方法通过细胞实验验证了核心分子靶点。第一部分基于网络药理学预测复方斑蝥胶囊治疗肝癌的分子靶点与机制目的:复方斑蝥胶囊在中医临床实践中被广泛用于治疗肝癌。然而,其治疗肝癌的分子靶点尚不清楚。本研究旨在阐明复方斑蝥胶囊治疗肝癌的分子靶点与机制。方法:首先,从公开数据库中检索复方斑蝥胶囊的生物活性成分和潜在靶点,以及HCC相关靶点。接下来,利用生物信息学分析确定复方斑蝥胶囊潜在靶点和HCC相关靶点之间的重叠基因。然后,构建了成分-靶点网络和基因-通路网络。结果:共筛选出151个复方斑蝥胶囊活性成分和255个潜在靶点,鉴定出982个HCC差异表达基因。最终筛选出34个重叠基因。此外,20条KEGG通路和429个GO术语显著丰富。蛋白质相互作用和基因通路网络表明,细胞周期蛋白B1（CCNB1）和细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）是复方斑蝥胶囊治疗肝癌的核心基因靶点。结论:复方斑蝥胶囊通过多组分、靶点和通路机制在肝癌中发挥治疗作用,其中CCNB1和CDK1可能是核心分子靶点。第二部分基于生物信息学分析核心靶点基因在肝癌中的表达和预后意义目的:基于网络药理学分析,CCNB1和CDK1可能是CMC治疗肝癌的核心分子靶点。本研究旨在基于生物信息学分析CCNB1和CDK1在肝癌中的表达及其预后意义。方法:我们主要使用两个独立的患者队列,即癌症基因组图谱（TCGA）队列和临床蛋白质组肿瘤分析联盟（CPTAC）队列,分别从m RNA和蛋白质水平分析CCNB1和CDK1在肝癌中的作用。首先,非肿瘤组织和HCC组织中CCNB1和CDK1的差异表达通过大量可公开访问的数据库验证。然后,采用Kruskal-Wallis秩和检验或Wilcoxon秩和检验以及逻辑回归分析CCNB1和CDK1表达与HCC临床病理特征的相关性。Cox回归和Kaplan-Meier分析用于评估预后意义。结果:肝癌组织中CCNB1和CDK1的m RNA和蛋白表达水平高于癌旁非肿瘤组织（均P＜0.05）。CCNB1和CDK1mRNA及蛋白表达与临床病理特征（临床分期、T分期、病理分级、肿瘤大小、门静脉癌栓）呈正相关,与HCC患者的生存率呈负相关。单因素和多因素Cox回归分析显示,CCNB1和CDK1的表达水平是肝癌患者的两个独立预后因素。结论:CCNB1和CDK1表达上调与肝癌预后不良有关。因此,CCNB1和CDK1可作为肝癌的治疗靶点。第三部分:基于血清药理学验证复方斑蝥胶囊治疗肝癌的核心分子靶点目的:CCNB1和CDK1可作为肝癌的治疗靶点,同时也可能是CMC治疗肝癌的核心分子靶点。本研究旨在通过细胞实验验证它们可以作为CMC治疗肝癌的核心分子靶点。方法:首先,根据血清药理学原理制备CMC含药血清,用于处理人肝癌细胞株Hep G2。然后进行CCK-8测定,以评估CMC对Hep G2细胞增殖的影响。采用定量逆转录聚合酶链反应（q RT-PCR）和免疫印迹（WB）检测CCNB1和CDK1的表达。最后,为了探讨CMC是否能影响肝癌细胞周期进程,我们用流式细胞术检测了不同浓度CMC含药血清处理后Hep G2细胞的细胞周期。结果:细胞实验结果显示CMC含药血清显著抑制Hep G2细胞的活力。此外,CMC下调CCNB1和CDK1的表达,并诱导G2/M期细胞周期阻滞。结论:CMC通过多组分、靶点和通路机制在HCC中发挥治疗作用,其中CCNB1和CDK1可能是核心分子靶点。本研究表明,网络药理学和生物信息学分析相结合,再辅以实验验证,可以作为研究中药治疗机制的有效工具。