论文部分内容阅读
目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)相关抗原诱导的特异性T细胞免疫应答;了解PML-RARα融合基因疫苗体内免疫效应,为开展APL的DNA疫苗治疗提供实验依据。方法:(1)利用RT-PCR扩增9例APL患者中29个TCR Vα亚家族基因的互补决定区3(CDR3),了解TCR Vα亚家族T细胞的分布;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。以10例正常人外周血作为对照。(2)采用混合淋巴细胞与肿瘤细胞培养(MLTC)方法,利用APL细胞体外诱导脐血T细胞增殖,分析脐血TCR Vα和Vβ亚家族的增殖特点,并应用LDH法分析诱导增殖的T细胞针对APL细胞特异性杀伤作用。(3)用成功构建的重组质粒(pIRES-PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠后分离注射部位肌肉,用RT-PCR及免疫组织化学染色法检测目的基因在小鼠骨骼肌中的转录和表达;ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况;LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率;用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARα抗体;探针法实时定量PCR检测T细胞受体删除DNA环(TRECs)而了解小鼠胸腺naiveT细胞水平。结果:(1)APL患者外周血T细胞最多能检测到7个TCR Vα亚家族,以Vα3和Vα19出现频率较高;克隆性增殖T细胞可在8例患者中检测到,以Vα3、Vα26和Vα27出现克隆性T细胞频率较高(3/8例)。(2)经APL细胞刺激后增殖的脐血T细胞表达部分Vα和Vβ谱系基因,并在Vα10、Vβ5和Vβ15出现有克隆增殖趋势,诱导后的T细胞对APL细胞的杀伤性均高于未诱导组。(3)小鼠注射部位肌肉中检测到PML-RARα及hIL-2基因的转录,并可检测到hIL-2蛋白的表达。免疫后第7周时,小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体、TRECs及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组。结论:APL细胞相关抗原可诱导T细胞特异性免疫应答,表现为TCR Vα和Vβ亚家族优势利用和克隆性增殖,且对APL细胞具有特异性细胞毒性作用。所构建的PML-RARα系列重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答,具有DNA疫苗的基本特性。