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耐高温FeSOD基因是从一株地热芽孢杆菌的新菌株中分离得到,全长1236bp,编码411个氨基酸残基,其编码的蛋白分子量预计为47.2kDa,等电点为4.74。
为了探索耐高温FeSOD的酶学和结构生物学性质,将该基因克隆到表达载体pET-28a中,成功构建重组质粒pET-28a-FeSOD。将重组质粒转化感受态细胞E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导(37℃)表达,通过SDS-PAGE和Western blotting检测到高压破碎的菌体上清样品中存在一特异性条带,与预期蛋白分子量47.2kDa相符。接下来通过镍柱亲和层析和阴离子交换层析对上清样品进行纯化,得到纯度在95%以上的目的蛋白,对纯化后的目的蛋白进行超滤浓缩,使其浓度达到晶体的最佳结晶范围内。通过一系列蛋白质结晶条件的摸索,探索出耐高温FeSOD的最佳结晶条件,得到的FeSOD蛋白晶体经X射线衍射分辨率为2.6(A)。通过收集的FeSOD蛋白晶体衍射数据,成功解析出其高级结构,结果表明:该酶是由四个相同亚基组成的四聚体,每个亚基含有8个α-螺旋,3个反向平行的β-折叠片,酶活性中心由β折叠形成的一个活性通道、铁离子以及与铁离子相连的3个His残基和1个Asp残基组成。
为了探索耐高温FeSOD的耐热机制,将耐高温FeSOD、耐高温MnSOD以及常温FeSOD这三种SOD三维结构的Cα重原子进行叠合分析。结果显示耐高温FeSOD与耐高温MnSOD的三维结构差异相对较大,而耐高温FeSOD与常温FeSOD的三维结构只存在一个较小的差异区域。常温FeSOD在差异区域由一个loop将α-螺旋分隔开,而耐高温FeSOD在这个区域全部由α-螺旋组成。由于α-螺旋是三维结构中最稳定的结构,而loop是非常不稳定的结构,这可能使得常温FeSOD结构的可变性增大,因此推断这个区域可能决定了耐高温FeSOD的耐热特性。将常温FeSOD这个区域的氨基酸序列与耐高温FeSOD、MnSOD进行比对,发现这两种耐高温SOD在这个区域均在含有Y(酪氨酸残基)的位置对应的常温FeSOD是F(苯丙氨酸残基),因此我们初步推断耐高温FeSOD372位的Y(酪氨酸残基)可能是决定耐热性的关键氨基酸,并通过突变实验将耐高温FeSOD372位的Y(酪氨酸残基)突变成F(苯丙氨酸残基),研究突变后蛋白耐热性的变化。
本课题完成了耐高温FeSOD蛋白的结晶,为后续研究SOD的结构生物学以及耐高温蛋白的耐热机制提供参考。