皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596是转化D，L-5-对羟基苯海因经N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸生产D-对羟基苯甘氨酸的工业菌株。其中，第二步反应由N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（简称D-氨甲酰水解酶）完成。该酶稳定性低难以重复利用。突变(A18T/Y30N/K34E)将该酶编码基因在大肠杆菌中的可溶性表达水平从20％提高80%，但该突变体(M3)的稳定性未改善。　　 本论文通过DNA混组、易错PCR、定点突变等手段改造M3获得Tm提高10℃的突变体B5(T262A/H248Q/Q23L/Q12L)。进而，通过氨基酸序列共义性方法确定了该酶上7个热稳定相关的位点(Met31、Asn93、Gln207、Asn242、Glu266、Thr271、Ala273)。通过组合饱和突变及迭代饱和突变将这些位点组合进B5所获最佳组合D1(Q12L/Q23L/Q207E/N242G/H248Q/T262A/T263 S/E266D/T271I/A273P)的Tm比M3提高16℃左右，并保持与出发酶相近的kcat、Km、最适反应pH及高可溶性。　　 将D-氨甲酰水解酶突变体固定化在Sepabeads EC-EP/A载体连续转化28批，M3、B5及D1的残余酶活分别为66%、78%、87%。在204小时内固定化D1可连续转化40批，而固定化M3只转化了28批。表明突变体固定化酶的使用寿命明显提高。　　 易修饰残基分布、疏水相互作用、芳香侧链间相互作用、离子键引入、环区及a-螺旋结构稳固、亚基的组装及聚体的形成等都会影响蛋白质的稳定性。氨基酸残基(Gln23、Met31、Gln207、Asn242、Met73、Met239和Met244)的突变降低了表面残基的脱酰胺化和氧化作用、T271/L及N93Y加强了疏水相互作用或和周围芳香残基相互作用、A273K/R突变引入表面离子键、Q207E和N242G稳定了局部环区结构，这些突变对D-氨甲酰水解酶局部的影响都可能导致其稳定性的提高。此外，发现突变位点(Th271、Asn242、His248、Thr262、Th263、Glu266和Ala273)分布在D-氨甲酰水解酶单体表面的高疏水区，四聚体亚基间接触的界面上。推测：这些氨基酸突变可能对亚基组装后维持该酶四聚体结构的稳定更有益。