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第一部分线粒体及不同Nox亚型来源的ROS在草酸介导NRK-52E细胞损伤中的作用[目的]初步鉴定草酸作用于肾小管上皮细胞时活性氧生成的来源,并初步鉴别其各自可能的作用。[方法]通过CCK-8及LDH释放实验测定草酸对NRK-52E细胞的毒性作用。分别使用DCF-DA和mitoSOX Red荧光探针来检测细胞内及线粒体内活性氧。JC-1荧光探针用来检测线粒体膜电位以评价线粒体功能。Wesstern blot法检测草酸作用于NRK-52E细胞时NADPH氧化酶主要亚基(Nox4,Nox2和p22)的表达情况。并使用特异性的NADPH氧化酶亚型抑制剂及靶向线粒体抗氧化剂初步鉴定不同来源活性氧在草酸介导的肾小管细胞毒性中的作用。[结果]草酸作用于NRK-52E细胞显著降低了细胞活力。草酸作用于NRK-52E时细胞内ROS生成伴随着p22和Nox4亚基蛋白表达的变化。同时线粒体也是ROS生成的来源。抑制Nox2生成的ROS或清除线粒体来源的ROS可以减轻草酸诱导的细胞损伤;而抑制Nox4/1来源的ROS反而加重了肾小管细胞损伤。[结论]不同来源的ROS在草酸介导的肾小管上皮细胞损伤中可能发挥了各自不同的作用。我们同时发现了一些新的潜在靶点可用于预防或减轻草酸介导的肾小管上皮细胞损伤。第二部分MitoTEMPO通过调节氧化应激和保护线粒体功能减轻草酸诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)损伤[目的]由基因缺陷或饮食等因素导致的高草酸尿症是泌尿系结石形成的重要危险因素之一。而高草酸介导的肾小管上皮细胞损伤与氧化应激及线粒体功能不全密切相关。该研究探索了mitoTEMPO,一种靶向线粒体的抗氧化剂是否能通过调节氧化应激和保护线粒体功能减轻草酸介导的NRK-52E细胞损伤。[方法]MitoSOX Red被用来检测线粒体内的活性氧生成。线粒体膜电位及ATP用来评价线粒体的功能。通过western blot检测了Nox4,Nox2和p22蛋白表达以明确草酸和mitoTEMPO对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH氧化酶)的影响。[结果]我们的研究结果显示mitoTEMPO预处理可以减轻草酸对NRK-52E诱导的乳酸脱氢酶(dehydrogenase,LDH)释放及丙二醛(malondialdehyde,MDA)生成,并减少了线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)生成。同时mitoTEMPO显著逆转了草酸诱导的细胞膜电位下降及ATP合成减少。另外mitoTEMPO逆转了草酸诱导的Nox4及p22蛋白表达变化;并显著下调了骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和IL-6的蛋白表达。[结论]我们推测mitoTEMPO可作为防治高草酸尿症介导的肾损伤及肾结石的理想候选药物。第三部分MitoTEMPO对高草酸尿大鼠模型的肾脏组织氧化应激及结石形成的影响作用研究[目的]氧化应激及线粒体功能不全在高草酸尿诱导的肾损伤及肾结石形成中发挥了重要作用。该研究探索靶向线粒体的抗氧化剂mitoTEMPO对高草酸尿诱导的肾组织氧化应激损伤及肾结石形成的影响。[方法]我们采用改良的腹腔注射乙醛酸方法建立高草酸尿及肾结石大鼠动物模型。Tunel染色用于检测肾小管上皮细胞凋亡情况。冰冻切片DHE染色用于检测肾组织内ROS水平。Western blot法检测NADPHoxidase主要亚基Nox4和p22在肾组织的表达情况。免疫组化及Western blot法检测OPN在肾脏内蛋白表达水平。硝酸银染色用来检测肾组织内草酸钙结晶沉积情况。[结果]高草酸尿模型鼠肾组织内肾小管上皮细胞凋亡明显增加,mitoTEMPO治疗可以减少肾小管上皮细胞凋亡;同时mitoTEMPO显著减轻了高草酸尿诱导的肾组织内ROS增多及脂质过氧化损伤。该动物模型肾组织内Nox2,Nox4,p22和OPN的蛋白表达水平均明显升高;而mitoTEMPO显著逆转了以上效应。在该模型中,mitoTEMPO可抑制肾内草酸钙结晶的形成。[结论]我们的研究初步表明mitoTEMPO可减轻高草酸尿介导的氧化应激损伤并调节结石相关分子的表达,可作为预防高草酸尿症介导的肾损伤及肾结石的候选药物。