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研究背景:外泌体是一种具有脂质双层膜结构的微小囊泡,直径在30-150nm之间,大多数活细胞均能分泌外泌体。外泌体中携带有多种蛋白质、mRNA等分子,在细胞间通讯中发挥了重要作用,影响细胞功能并与多种疾病的发生发展有关。肿瘤细胞分泌的外泌体(TEX)中存在肿瘤相关抗原,可以被抗原呈递细胞摄取并呈递,诱导出肿瘤特异性T细胞。在此基础上可以对外泌体进行工程化改造,进一步增强其刺激宿主免疫功能的效果。α-gal表位在非灵长类哺乳动物的细胞中广泛存在,人体中不存在α-gal表位但血清中存在anti-gal抗体。抗体与α-gal表位特异性结合后,可以诱导出免疫反应。α-gal表位强大的免疫原性为结直肠癌的免疫治疗提供了新的思路。结直肠癌患者体内的免疫细胞功能受到抑制,不能产生足够的抗肿瘤免疫应答。这也是许多免疫治疗临床试验效果不理想的原因。过继免疫细胞治疗可以解决这一问题。研究目的:通过慢病毒载体在亲代肿瘤细胞中表达α-gal表位,分离存在α-gal表位的肿瘤细胞外泌体,与DC-CTL过继细胞培养技术相结合,探索使用α-gal工程化肿瘤细胞外泌体诱导出抗瘤活性更强的肿瘤特异性T细胞治疗结直肠癌的可行性。研究方法:1)建立调控αl,3GT基因表达的慢病毒载体,转染结直肠癌细胞SW480,建立稳定表达α-gal表位的SW480-α-gal细胞系。2)利用超速离心法分离SW480、SW480-α-gal两种细胞系的外泌体,并通过电镜、NTA及Western blot对提取的外泌体质量进行鉴定,通过ELISA鉴定外泌体α-gal表位情况。3)抽取健康志愿者外周血,分离PBMC体外培养DC和CTL细胞。分别使用SW480肿瘤细胞裂解物(Lys)、SW480肿瘤细胞外泌体(TEX)以及SW480-α-gal肿瘤细胞外泌体(TEX-gal)作为抗原负载DC,诱导CTL细胞。采用流式细胞术检测DC细胞表型及CTL细胞亚群情况,通过AimPlex技术检测DC细胞分泌的Thl反应相关因子IL-12p70、IFN-y,Th2反应相关因子IL-13、IL-10,促炎反应相关因子IL-6、TNF-α以及CTL细胞分泌的IFN-y、IL-6、IL-4和IL-13水平。4)通过LDH释放法检测不同CTL细胞的体外杀伤能力。建立裸鼠皮下荷瘤模型,瘤内多点注射不同抗原诱导的CTL细胞,比较各组CTL对肿瘤生长的抑制效果,对肿瘤组织进行HE及免疫组化染色观察肿瘤内部免疫细胞浸润情况。研究结果:1)经过酶切及测序鉴定,成功构建了慢病毒载体。以最优MOI 150感染SW480细胞,成功建立了稳定表达α-gal表位的SW480-α-gal细胞系。2)超速离心法成功提取SW480、SW480-α-gal肿瘤细胞外泌体,透射电镜下可观察到典型的茶托样双层膜结构,NTA结果表明提取的外泌体颗粒直径分布较为集中。Western blot鉴定分离的外泌体存在标志物CD9、CD63及肿瘤抗原EGFR表达,ELISA鉴定SW480-α-gal肿瘤细胞分泌的外泌体(TEX-gal)中存在α-gal表位。3)TEX-gal负载DC的成熟度更高,Thl反应相关因子IL-12p70、IFN-y分泌水平增加,Th2反应相关因子IL-13及IL-10分泌水平降低,促炎反应相关因子IL-6分泌水平降低而TNF-α分泌水平增加。TEX-gal诱导的CTL-TEX-gal中CTL细胞亚群及NKT细胞亚群比例升高,NK细胞亚群比例降低,CTL-TEX-gal分泌的IFN-γ水平增加。4)CTL-TEX-gal体外杀伤能力增强,能显著抑制裸鼠皮下瘤体积增长。HE及免疫组化染色结果表明,瘤内注射CTL-TEX-gal可以显著破坏肿瘤内部结构,肿瘤内可见大量CD8+CTL细胞浸润,残存肿瘤组织较少。研究结论:1)利用慢病毒载体可以成功在结直肠癌SW480细胞表面表达α-gal表位,转染后的SW480-α-gal细胞分泌的外泌体中存在α-gal表位。2)TEX-gal负载的DC成熟度更高,Thl反应相关因子分泌增加,诱导出的CTL-TEX-gal中CTL细胞亚群比例升高,分泌IFN-γ水平增加。3)TEX-gal负载DC诱导出的CTL-TEX-gal体外杀伤及体内抗肿瘤活性更强。