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全球约有4亿人缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD),使其成为最常见的人体酶缺乏症。当G6PD缺陷的个体接触氧化物时,可能出现溶血,如新鲜蚕豆,抗疟疾药等,故又称“蚕豆病”。苯是一种常见的工业基本原料,也是环境中重要的污染物,苯通过不同途径进入机体后,经过一系列代谢,最后在骨髓生成终致癌物1,4-苯醌(1,4-BQ)。慢性职业苯暴露可影响骨髓造血功能,引起白细胞减少,再障,骨髓增生异常综合征(MDS),甚至白血病。课题组前期研究发现,G6PD缺陷会增强1,4-BQ所致的K562细胞氧化应激、细胞增殖抑制、凋亡和自噬水平;G6PD缺陷小鼠转录组测序研究发现G6PD缺陷可致小鼠骨髓细胞CAMK2B基因异常高表达。鉴于骨髓造血细胞是苯造血毒性的重要靶标,造过度的氧化应激可能影响造血干细胞的更新与分化,故本研究拟在前期研究的基础上,进一步研究G6PD缺陷对小鼠骨髓造血干细胞更新与分化能的影响,探讨G6PD缺陷与苯造血毒性易感性之间的关系,并进一步研究G6PD缺陷小鼠骨髓细胞CAMK2B异常表达对细胞毒性作用的影响。1.G6PD缺陷对苯致小鼠骨髓造血功能的影响首先构建G6PD缺陷(G6pdxa-m1Neu/Y)小鼠,通过测序和荧光定量PCR法鉴定小鼠的基因型。对G6PD缺陷小鼠和正常对照小鼠,通过皮下注射进行苯染毒,苯暴露剂量为80mg/(kg·d)和150mg/(kg·d),构建苯中毒小鼠模型。通过分析小鼠骨髓造血干细胞、红系祖细胞、粒系祖细胞和淋巴系祖细胞的比例及骨组织病理切片HE染色结果,探讨G6PD缺陷对苯致小鼠骨髓造血干细胞更新与分化的影响。研究结果显示,G6PD缺陷小鼠与对照小鼠相比,造血干细胞(lin~-sca1~+ckit~+)和lin~-sca1~+细胞比例明显升高,差异具有统计学意义;粒系祖细胞比例明显升高,红系祖细胞和淋巴系祖细胞比例没有明显改变。苯染毒后,G6PD缺陷小鼠与对照小鼠的造血干细胞、lin~-sca1~+细胞、lin~-ckit~+细胞、粒系祖细胞、红系祖细胞和淋巴系祖细胞比例均明显下降,且随着苯染毒剂量的增加,造血干细胞和三系祖细胞比例下降更为明显;与对照小鼠相比,G6PD缺陷小鼠在苯染毒后的造血干细胞、lin~-sca1~+细胞和粒系祖细胞比例下降更为明显。正常小鼠和G6PD缺陷小鼠骨髓腔中有大量骨髓细胞,未见病理改变。高剂量苯染毒后,小鼠骨髓造血细胞明显减少。以上结果表明,G6PD缺陷对苯致小鼠骨髓造血干细胞更新和分化功能的影响更为显著,表现出更明显的造血毒性。2.CAMK2B在G6PD缺陷小鼠的异常表达及其参与1,4-苯醌毒性作用的研究课题组前期研究发现,苯暴露后G6PD缺陷小鼠和对照小鼠骨髓细胞CAMK2B的表达有明显差异。在上述动物实验中,收集G6PD缺陷(G6pdxa-m1Neu/Y)小鼠和对照小鼠骨髓细胞,通过RT-PCR、Western blot和免疫组化检测G6PD缺陷小鼠CAMK2B的基因和蛋白表达水平。RT-PCR结果显示,G6PD缺陷小鼠CAMK2B的mRNA表达量高于对照小鼠;Western blot结果和免疫组化结果显示,G6PD缺陷小鼠CAMK2B蛋白表达量高于对照小鼠,且大多表达在胞膜和胞质。应用CAMK2B的化学抑制剂KN93建立CAMK2B低表达的K562细胞株,通过MTT细胞增殖实验、RT-PCR和Western blot检测KN93对细胞增殖抑制情况、细胞中CAMK2B的mRNA和蛋白的表达,筛选合适的KN93浓度以建立CAMK2B低表达细胞模型;CAMK2B低表达细胞建立成功后,用1,4-BQ处理CAMK2B低表达K562细胞和对照细胞,通过检测细胞增殖率、活性氧(ROS)含量、ATP生成量、线粒体膜电位、钙离子浓度、细胞凋亡和细胞周期研究1,4-BQ染毒后细胞功能的改变,探讨CAMK2B低表达对1,4-BQ致细胞线粒体功能的影响。研究结果显示,CAMK2B低表达细胞内ROS水平高于阴性对照细胞,且CAMK2B低表达细胞和对照细胞ROS水平随着1,4-BQ浓度的增加而升高;CAMK2B低表达细胞的ATP生成量低于对照细胞,随着1,4-BQ浓度的增加,两种细胞线粒体ATP的生成量都减少,CAMK2B低表达细胞的ATP生成量仍低于对照细胞;CAMK2B低表达细胞的线粒体膜电位低于对照细胞,随着1,4-BQ浓度的增加,两种细胞线粒体膜电位都呈下降趋势,CAMK2B低表达细胞的线粒体膜电位仍低于对照细胞;CAMK2B低表达细胞内的钙离子浓度高于对照细胞,随着1,4-BQ浓度的增加,细胞内钙离子浓度随之增加,但CAMK2B低表达细胞内的钙离子浓度仍高于对照细胞;CAMK2B低表达细胞凋亡率高于对照细胞,随着1,4-BQ浓度的增加,两种细胞的凋亡率都明显增加,CAMK2B低表达细胞凋亡率仍高于对照细胞;CAMK2B低表达细胞出现G1期和S期的减少,G2期的增加,在1,4-BQ染毒后,CAMK2B低表达细胞出现明显的S期的增加和G2期的降低。以上结果提示,CAMK2B对细胞的抗氧化损伤具有重要作用和意义,G6PD缺陷小鼠CAMK2B高表达可能是G6PD缺陷小鼠抗氧化的保护因素,而苯暴露可致CAMK2B表达降低,这可能是G6PD缺陷对苯致小鼠骨髓造血毒性影响更为显著的机制之一。结论1.G6PD缺陷小鼠的造血干细胞、lin~-sca1~+细胞和粒系祖细胞比例高于对照小鼠;苯中毒小鼠模型构建成功后,G6PD缺陷小鼠骨髓造血干细胞更新与分化功能产生明显的损伤,表现出更明显的造血毒性。2.G6PD缺陷小鼠CAMK2B基因异常高表达。在CAMK2B抑制细胞模型中,1,4-BQ染毒后,CAMK2B低表达细胞出现更明显的线粒体损伤,CAMK2B对于细胞的抗氧化损伤具有重要意义。苯暴露可致CAMK2B表达降低,这可能是G6PD缺陷对苯致小鼠骨髓造血毒性影响更为显著的机制之一。