背景食管癌(esophageal cancer,EC)是人类十大恶性肿瘤之一,中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家,其中以食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)为主。随着社会经济地位,生活方式和医疗水平的改善,我国食管癌的发病率和死亡率呈逐年下降的趋势,但患者的5年生存率仍然很低,目前仍是治疗的难点,其主要原因就是肿瘤的侵袭和转移。近年来,国内外研究发现,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是多细胞生物胚胎发生过程的基础,其在组织重建、伤口修复等过程中都有发挥重要作用。此外,EMT也是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得侵袭、迁移和抗凋亡能力的重要生物学进程。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs),是一类依赖金属钙离子(Ca2+),锌离子(Zn2+)的内肽酶家族,它的主要功能就是几乎能降解细胞外基质的各种蛋白组分。其中,MMP-9又称为明胶酶B,作为降解细胞外基质和基底膜的关键酶,对恶性肿瘤的发展、侵袭转移及间质血管生成起着重要的作用。最近研究表明,MMP除了可以降解细胞外基质的各种蛋白组分之外,一些MMP(如MMP-3 MMP-9、MMP-14和MMP-28等)可以诱导EMT或EMT相关进程。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1是调节EMT的关键因素之一,它广泛参与人类各种恶性肿瘤EMT的发生。更为重要的是,有研究报道,MMP-9参与TGF-β诱导肾小球内皮细胞EMT进程。这说明MMPs在TGF-β介导的EMT中起到重要的作用。截至目前,MMP-9是否参与食管鳞癌EMT进程,MMP-9是否参与TGF-β1诱导的食管鳞癌EMT进程,这些都尚未见报道。本研究为了解决这些问题,将从以下四个部分进行研究。第一部分食管鳞癌组织中MMP-9、Snail和TGF-β1的表达与EMT的关系及临床意义目的:探讨MMP-9、Snail和TGF-β1与E-cadherin的关系及其与临床病理学因素的关系。方法:1.采用免疫组化SP法检测77例食管鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中MMP-9、Snail、TGF-β1和E-cadherin蛋白的表达情况。2.分析MMP-9与Snail、TGF-β1和E-cadherin的关系及与性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤TNM分期等临床病理参数的关系。结果:1.食管鳞癌组织较癌旁正常组织表达MMP-9(74.03%vs31.17%)、Snail(68.83%vs 25.97%)、TGF-β1(71.43%vs 36.36%)明显增高(P<0.01),E-cadherin(44.16%vs 100.0%)明显下降(P<0.01)。2.MMP-9蛋白表达与肿瘤组织学分级(I vsII vs III:58.33%vs 77.27%vs100.0%,P<0.05)、肿瘤浸润深度(T1 vs T2 vs T3:42.86%vs 65.0%vs 88.37%,P<0.01)、淋巴结转移(无vs有:67.21%vs 100.0%,P<0.01)及TNM分期(I vsII vsIII:66.67%vs 67.39%vs 100.0%,P<0.05)呈正相关,而与性别、年龄无关(P>0.05)。Snail蛋白表达与肿瘤浸润深度(T1 vs T2 vs T3:35.71%vs75.00%vs 76.74%,P<0.05)、淋巴结转移(无vs有:60.66%vs 100.0%,P<0.01)呈正相关,而与性别、年龄、肿瘤组织学分级及TNM分期无关(P>0.05)。TGF-β1蛋白表达与淋巴结转移(无vs有:65.57%vs 93.75%)和TNM分期(I vsII vsIII:46.67%vs 73.91%vs 87.50%)呈正相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤组织学分级及肿瘤浸润深度无关(P>0.05)。E-cadherin蛋白表达与肿瘤浸润深度(T1 vs T2 vs T3:71.43%vs 55.0%vs 30.23%)和淋巴结转移(无vs有:50.82%vs 18.75%)呈负相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤组织学分级、浸润深度及TNM分期无关(P>0.05)。3.食管鳞状细胞癌组织中,MMP-9与Snail蛋白呈正相关(γs=0.292,P<0.01)。MMP-9与E-cadherin蛋白呈负相关(γs=–0.295,P<0.01);Snail与E-cadherin蛋白呈负相关(γs=–0.241,P<0.01)。MMP-9与TGF-β1蛋白呈正相关(γs=0.327,P<0.01);TGF-β1与E-cadherin蛋白呈负相关(γs=–0.432,P<0.01)。第二部分MMP-9在食管鳞癌EMT中的作用及对其侵袭迁移的影响目的:探讨MMP-9对食管鳞癌细胞上皮间质转化及侵袭迁移能力的影响及可能的机制。方法:1.MMP-9表达上调对食管鳞癌EMT及侵袭迁移能力的影响:外源性重组人MMP-9(rMMP-9)蛋白刺激食管鳞癌EC-1细胞株不同时间(0 h,24 h,48 h),于倒置显微镜观察细胞形态学改变;Real-time PCR,Western blot及细胞免疫荧光方法检测E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表达变化;采用侵袭实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。2.MMP-9表达下调对食管鳞癌EMT及侵袭迁移能力的影响:MMP-9shRNA稳定转染食管鳞癌EC-1细胞株48h,于倒置显微镜观察细胞形态学改变;Real-time PCR,Western blot及细胞免疫荧光方法检测E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表达变化;采用侵袭实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。3.通过Real-time PCR和Western blot方法检测MMP-9表达上调/下调后对食管鳞癌EC-1细胞中Snail表达的影响。4.利用siRNA技术干扰Snail的表达,然后用rMMP-9刺激EC-1细胞48h后,通过Real-time PCR和Western blot方法检测EC-1细胞EMT分子标记物E-cadherin和Vimentin的表达变化;采用侵袭实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。结果:1.MMP-9表达上调对食管鳞癌EMT及侵袭迁移能力的影响:外源性rMMP-9刺激食管鳞癌EC-1细胞株后,细胞形态发生明显变化,由上皮细胞形态向间质细胞形态转变,以48h最为显著。Real-time PCR和Western blot结果显示,与空白组(0h)相比,rMMP-9刺激后E-cadherin mRNA[24h组(0.62±0.07 vs1.00±0.00)、48h组(0.48±0.09 vs1.00±0.00),均P<0.01]及蛋白[24h组(0.51±0.0.07vs 0.67±0.05),P<0.05、48h组(0.43±0.09 vs 0.67±0.05),P<0.01]的表达明显降低,Vimentin mRNA[24h组(1.30±0.08 vs1.00±0.00)、48h组(1.58±0.09vs1.00±0.00),均P<0.01]及蛋白[24h组(0.66±0.07 vs 0.50±0.07),P<0.05、48h组(0.77±0.06 vs0.50±0.07),P<0.01]的表达明显上调。细胞免疫荧光结果和Western blot结果相一致。此外,细胞侵袭实验和划痕实验结果显示:与空白组(0h)相比,rMMP-9刺激组细胞的穿膜细胞数(113±12 vs 75±9)显著增多及划痕愈合能力(0.66±0.05vs 0.43±0.07)显著增强(P<0.05)。2.MMP-9表达下调对食管鳞癌EMT及侵袭迁移能力的影响:MMP-9shRNA稳定转染食管鳞癌EC-1细胞株后,与空白组和阴性对照组(转染无义序列)相比,MMP-9 shRNA组中部分细胞形态由长梭形或间质样形态向上皮细胞形态转变,细胞粘附性增强,细胞与细胞间的连接变的紧密;Real-time PCR和Western blot结果显示,与阴性对照组和空白组相比,MMP-9 shRNA组中MMP-9mRNA(0.36±0.05 vs 0.92±0.07 vs 1.00±0.00)及蛋白(0.48±0.05 vs 0.64±0.06 vs0.72±0.08)的表达明显下调(P<0.01),E-cadherin mRNA(1.75±0.09 vs 0.90±0.07vs 1.00±0.00)及蛋白(0.80±0.06 vs 0.57±0.05 vs 0.62±0.08)的表达明显上调(P<0.01),Vimentin mRNA(0.70±0.08 vs 0.91±0.05 vs 1.00±0.00)及蛋白(0.48±0.03vs 0.63±0.04 vs 0.68±0.07)的表达明显下调(P<0.05)。细胞免疫荧光结果和Western blot结果相一致。此外,细胞侵袭实验和划痕实验结果显示:与阴性对照组和空白组相比,MMP-9 shRNA组细胞穿膜细胞数(49±5 vs 78±4 vs 82±8)显著降低及划痕愈合能力(0.25±0.07 vs 0.43±0.08 vs 0.44±0.05)显著减弱(P<0.05)。3.MMP-9对食管鳞癌细胞中调节EMT的关键分子Snail的影响:Real-time PCR和Western blot结果显示,当MMP-9表达上调时,与空白组(0h)相比,Snail mRNA[24h组(1.55±0.08 vs 1.00±0.00)、48h组(2.29±0.11 vs 1.00±0.00),均P<0.01]及蛋白[24h组(0.69±0.04 vs 0.56±0.08),P<0.05、48h组(0.80±0.07vs0.56±0.08),P<0.01]的表达显著增加;当MMP-9表达下调时,与阴性对照组及空白组相比,MMP-9 shRNA组中Snail mRNA(0.65±0.08vs 0.90±0.08 vs1.00±0.00)及蛋白(0.54±0.08vs 0.69±0.04vs 0.72±0.06)表达显著降低(P<0.01)。4.Snail表达下调对食管鳞癌EMT及侵袭迁移能力的影响:Real-time PCR和Western blot结果显示,与空白组相比,Snail siRNA组中Snail mRNA(0.43±0.04vs 1.00±0.00)及蛋白(0.31±0.05 vs 0.51±0.07)的表达水平显著下调(P<0.01),E-cadherin mRNA(1.49±0.07 vs 1.00±0.00)及蛋白(0.82±0.06 vs 0.66±0.03)的表达水平显著上调(P<0.01),Vimentin mRNA(0.56±0.08 vs 1.00±0.00)及蛋白(0.37±0.05 vs 0.52±0.06)的表达水平显著下调(P<0.01);穿膜细胞数(42±8vs 82±4)显著降低及划痕愈合能力(0.21±0.09 vs 0.41±0.05)显著减弱(P<0.05)。5.Snail表达下调对MMP-9介导的食管鳞癌EMT及侵袭迁移能力的影响:Real-time PCR和Western blot结果显示,与rMMP-9组相比,Snail siRNA+rMMP-9组中E-cadherin mRNA(0.72±0.06 vs 0.44±0.09)及蛋白(0.57±0.04 vs0.45±0.05)的表达水平升高(P<0.01),Vimentin mRNA(0.73±0.09 vs 1.36±0.08)及蛋白(0.44±0.05 vs 0.80±0.04)的表达水平下降(P<0.01);穿膜细胞数(61±10vs 121±9)降低及划痕愈合能力(0.34±0.06 vs 0.59±0.04)减弱(P<0.01)。第三部分MMP-9在TGF-β1诱导食管鳞癌EMT中的作用及对其侵袭迁移的影响目的:探讨MMP-9在TGF-β1介导食管鳞癌EMT中的作用及对其侵袭迁移的影响。方法:1.TGF-β1(10ng/ml)处理食管鳞癌EC-1细胞不同时间(0 h,24 h,48 h),于倒置显微镜观察细胞形态学改变;采用Real-time PCR、Western blot及细胞免疫荧光方法检测E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表达变化。2.广谱MMP抑制剂GM6001处理食管鳞癌EC-1细胞后,于倒置显微镜观察细胞形态学改变;采用Real-time PCR、Western blot及细胞免疫荧光方法检测E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表达变化。3.采用Real-time PCR,荧光素酶报告实验,明胶酶谱实验及Western blot,检测TGF-β1处理食管鳞癌EC-1细胞后MMP-9 mRNA及蛋白的表达变化。4.利用shRNA干扰MMP-9的表达,然后用TGF-β1刺激细胞48h后,采用Real-time PCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白的表达变化,侵袭小室实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。结果:1.TGF-β1诱导食管鳞癌EMT:与空白组(0h)相比,TGF-β1刺激后细胞形态发生明显变化,由典型的鹅卵石样上皮细胞形态向长梭形或纺锤型间质细胞形态转变,刺激48h时最为显著。Real-time PCR和Western blot结果显示,与空白组(0h)相比,TGF-β1刺激后E-cadherin mRNA[24h组(0.65±0.04 vs1.00±0.00)、48h组(0.46±0.08 vs 1.00±0.00)]及蛋白[24h组(0.51±0.03 vs 0.67±0.06)、48h组(0.39±0.06 vs 0.67±0.06)]的表达明显降低(P<0.01),Vimentin mRNA[24h组(1.27±0.12 vs 1.00±0.00)、48h组(1.40±0.07 vs 1.00±0.00),均P<0.01]及蛋白[24h组(0.65±0.07 vs 0.53±0.06),P<0.05、48h组(0.73±0.06 vs 0.53±0.05),P<0.01]的表达明显增加。细胞免疫荧光结果和Western blot结果相一致。2.GM6001抑制TGF-β1诱导食管鳞癌EMT:于倒置显微镜下观察细胞形态,结果显示:与TGF-β1组相比,TGF-β1+GM6001组中部分细胞由原来的长梭形或纺锤形间充质细胞形态向上皮细胞形态转变。Real-time PCR和Western blot结果显示,与TGF-β1组相比,TGF-β1+GM6001组中E-cadherin mRNA(0.62±0.04vs 0.44±0.07)及蛋白(0.55±0.03 vs 0.44±0.06)的表达水平升高(P<0.05),而Vimentin mRNA[(1.22±0.03 vs 1.42±0.07),P<0.05]及蛋白[(0.71±0.03 vs0.82±0.05),P<0.01]的表达水平降低,差异均有统计学意义。细胞免疫荧光结果和Western blot结果相一致。3.TGF-β1促进MMP-9表达上调:明胶酶谱实验结果显示:与空白组相比,TGF-β1组细胞MMP-9活性明显增高,GM6001组细胞MMP-9活性明显降低;与TGF-β1组相比,TGF-β1+GM6001组中MMP-9活性降低。Real-time PCR结果显示,与对照组(0h)相比,TGF-β1处理组中MMP-9 mRNA[24h组(1.25±0.10vs 1.00±0.00)、48h组(1.42±0.07 vs 1.00±0.00)]的表达水平升高,且具有时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.01)。荧光素酶报告实验结果显示,在转染内参质粒pGL3-Basic的实验中,空白组和TGF-β1组中MMP-9荧光素酶活性表达均无显著性差异(P>0.05)。在转染重组质粒pGL3-MMP-9的实验中,与空白组相比,TGF-β1组中MMP-9的活性(17.26±3.69 vs 36.06±5.27)显著上调,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组(0h)相比,TGF-β1处理组中MMP-9蛋白[24h组(0.64±0.08 vs 0.52±0.04),P<0.05、48h组(0.77±0.08vs 0.52±0.04),P<0.01]的表达水平升高,且具有时间依赖性,差异有统计学意义。4.MMP-9表达下调抑制TGF-β1诱导食管鳞癌细胞EMT及细胞侵袭和迁移能力:Real-time PCR和Western blot结果显示,与空白组相比,MMP-9 shRNA组中MMP-9 mRNA(0.42±0.05vs 1.00±0.00)及蛋白(0.31±0.04vs 0.57±0.06)的表达水平显著下调(P<0.01),E-cadherin mRNA(1.53±0.08 vs 1.00±0.00)及蛋白(0.80±0.05vs 0.67±0.06)的表达水平显著上调(P<0.01),Vimentin mRNA(0.57±0.08vs 1.00±0.00)及蛋白(0.37±0.05 vs 0.53±0.08)的表达水平显著下调(P<0.01);与TGF-β1组相比,MMP-9 shRNA+TGF-β1组中E-cadherin mRNA[(0.71±0.06vs 0.46±0.08),P<0.01]及蛋白[(0.58±0.05vs 0.45±0.06),P<0.05]的表达水平升高,Vimentin mRNA(0.70±0.04vs 1.40±0.07)及蛋白(0.42±0.04vs 0.82±0.03)的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。此外,细胞侵袭和划痕实验结果显示,与空白组相比,MMP-9 shRNA组中穿膜细胞数(27±4 vs 69±5)显著降低,细胞划痕愈合能力(0.26±0.07vs 0.46±0.08)显著减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);与TGF-β1组相比,MMP-9 shRNA+TGF-β1组中穿膜细胞数(58±6 vs 119±7)降低及划痕愈合能力(0.36±0.04vs 0.64±0.06)减弱(P<0.01)。第四部分MMP-9阻断对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长及EMT的影响目的:研究MMP-9 shRNA在体内对食管鳞癌EMT的影响。方法:1.建立EC-1食管鳞癌裸鼠移植瘤模型,将MMP-9 shRNA转染组、阴性对照组(转染无义序列)细胞及空白组EC-1细胞分别注入裸鼠右前肢腋背部皮下,观察移植瘤的形成及生长状况并绘制生长曲线。2.实验结束后,取瘤称重,测量体积并拍照。3.HE染色观察食管鳞癌移植瘤组织学形态;采用Real-time PCR及免疫组织化学方法检测不同组别移植瘤MMP-9、Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白的表达。结果:1.成功建立了裸鼠食管鳞癌移植瘤模型。2.实验结束时,与阴性对照组和空白组相比,MMP-9 shRNA组中移植瘤体积(mm~3)(624.69±136.85 vs1118.19±254.85vs 1280.74±371.78)和重量(g)(0.58±0.13 vs0.94±0.17vs1.04±0.20)明显减少(P<0.05)。3.与阴性对照组和空白组相比,MMP-9 shRNA组中MMP-9 mRNA(0.48±0.06 vs 0.92±0.05 vs 1.00±0.00)及蛋白(82±7 vs 114±6 vs 125±9)明显降低(P<0.01)。Snail mRNA(0.60±0.10 vs 0.96±0.05 vs 1.00±0.00,P<0.05)及蛋白(87±8 vs124±4 vs 132±10,P<0.01)明显降低。E-cadherin mRNA(1.48±0.08vs 0.94±0.08 vs 1.00±0.00,P<0.01)及蛋白(134±12 vs 91±32 vs 87±12,P<0.05)表达明显上调,Vimentin mRNA(0.70±0.06 vs 0.95±0.03 vs 1.00±0.00,P<0.01)及蛋白(68±6 vs 102±44 vs 122±8,P<0.05)明显下调。结论1.MMP-9在食管鳞癌组织中的高表达状态与Snail、TGF-β1呈正相关性,与E-cadherin呈负相关性,提示三者在促进食管鳞癌EMT中具有协同作用。2.MMP-9参与食管鳞癌的EMT,且可通过EMT途径促进食管鳞癌侵袭和迁移。3.MMP-9通过调控Snail影响食管鳞癌EMT进程及侵袭转移。4.MMP-9介导的食管鳞癌EMT受到TGF-β1的调控。5.MMP-9 shRNA能有效抑制MMP-9的活性可下调Snail的表达并抑制食管鳞癌移植瘤EMT的发生。