生物体的生长和发育，是以细胞的生长和分裂，即细胞的增殖与分化为条件的。细胞增殖与分化是多阶段、多因子参与的有序过程，而这一切正是通过细胞周期精密调控来实现的。当细胞增殖分化失去正常的调控时，就有可能发生癌变。随着科学技术的发展，科学家对于细胞周期的认识越来越深入，对细胞周期的调控已作了大量的研究，并发现了大量细胞周期调控蛋白。但是，对于不同细胞信号最终如何通过细胞周期来控制细胞增殖这一重要问题，仍然所知有限。对于这一问题的深刻认识，将对控制癌肿的生长以及治疗，具有重大意义。 利用“基于PCR的减法杂交技术”研究了维甲酸诱导早幼粒白血病细胞分化和凋亡时所表达的特异基因，得到了一系列新基因克隆片段。本研究是在此基础之上对其中一个基因片断（Apr1，GeneBank Accession Number：AF143235）进行全长cDNA克隆，并研究其生物学功能。 第四军医大学硕上学位谊文 利用生物信息学技术，通过EST拼接，对Aprl序列进行了延长，得到 1474hp长的序列。采用Clontech的12组织mRNA膜进行Northern杂交分 析，发现该CDNA片断全长约1．skb，这样所拼接的序列实际接近。DNA全 长。为了验证该拼接序列的正确性，利用PCR技术对该基因进行扩增并再 测序，发现拼接序列在编码区少一个碱基，正确序列长为 1475hP，同时对基 因数据库序列进行了更正，该序列已经得到GeneBank的正式认可，认可号 为 NM of 406。 基于计算机基因分析，该 cDNA编码 ZIg个氨基酸，分子量约 26kD。 同时该基因表达蛋白与神经细胞生长抑制因子则ecdin）的功能结构域高度同 源N9％），且均为碱性蛋白，同属于 MAGE（黑色素瘤相关抗原 melanoma associated antigen）家族，组织mRNA表达分布研究表明，它们主要在终末分 化细胞中表达，神经组织中表达较高，在肿瘤组织极少表达或不表达，与 Necdin的表达谱一致。因此我们重新命名为Restin（细胞静息相关蛋白）。 黑色素瘤抗原基因最早是从黑色素瘤中分离得到的，被证实几乎在所有 肿瘤组织中表达，这使人们想到可将MAGE基因应用于肿瘤免疫治疗， MAGE多肽正作为免疫制剂应用于临床研究中。尽管MAGE家族的23个人的 和12个鼠的同源基因己从各种肿瘤中分离鉴定，但它们在正常组织中的生物 学功能还不清楚。多数MAGE基因有一个共同的特征：它们都特异表达在许 多肿瘤组织和成人睾丸中；其C末端均含有长约200个氨基酸的MAGE同源结 构域；都定位于X染色体。己知MAGE家族有23个成员，依据它们的同源序 列和染色体定位分为四个亚家族：＊哈今A、B、C、D。＊呛0A亚家族包括 12个成员，定位于Xg28，MAGE·B的6个成员定位于XpZ122，3个MAGE－C 成员定位于Xq26上7，MAGE·D亚家族的两个成员在Xpl。 在成人，多数MAGE基因表达在睾丸中，这种表达方式暗示了这个基因 家族和生殖细胞的发育有关。与MAGE基因相比较，其相关基因necdin有较 Dpartmnt of Bioch～istry rha Fourth’ilitaFI edical UnirarsitlN 3页 第四军医大学硕上学位论文 多生物学功能研究的结果。该基因是一个编码325个氨基酸的核蛋白，与 MAGE蛋白同源性达30％。necdin蛋白表达于鼠的有丝分裂后期神经元，导 致其生长抑制。将necdin导入NTH3T3细胞，可以抑制细胞的生长但不影响 细胞活性。而且，necdin还可与细胞周期促进蛋白相互作用，如SV40大T抗 原，腺病毒曰 和转录因子EZFI。EZFI蛋白是细胞周期中的重要成员，特异 地结合转录基因参与细胞周期，这条通路是由Rb蛋白调节的，Rb在GI期与 EZFI的转录结构结合，抑制EZFI的活性。当细胞进入S期时，由于Rb磷酸化 失活，EZFI激活细胞周期基因。 Necdin类似子Rb，通过结合EZFI使其失活导致细胞生长停滞。Necdin也 可以与抑癌基因p53作用，参与生长抑制和凋亡作用。Necdin结合p53转录结 构域，从而抑制p53诱导的凋亡和阻止p53依赖的pZI／WAF活化。尽管Necdin 抑制pZI／WAF启动子的活性，但它不抑制p53对SAOS上细胞的生长阻滞。在 这些细胞中，p53和Necdin以累加的方式抑制细胞主长。因此，Necdin极有可 能是一特异的生长抑制因子，在早期神经元中与p53和EZFI蛋白结合的抗凋 亡蛋白。 将restin基因克隆到作者构建的大肠杆菌高效表达载体pLDH99中，得 到大小约为26KU的表达蛋白，初步纯化后，免疫新西兰白兔制备抗体，成 功地制备了兔抗restin血清，为该基因的功能研究?