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背景:人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV),是一种可以使人体免疫功能逐渐下降,导致获得性免疫缺陷综合症的主要病原体,由于缺少有效的疫苗或彻底治疗的药物,目前已成为全球关注的焦点。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类不编码蛋白质的RNA,其转录本长度大于200个核苷酸,广泛参与多种生物学进程,发挥着重要的调控作用,如物种进化、个体发育、癌症、免疫应答等。值得注意的是,其异常表达还与多种人类重大疾病密切相关。已有研究表明,宿主中多种lncRNAs在不同病毒感染过程中存在差异表达,这提示了 lncRNA可能参与调控病毒复制。目前,已发现少数差异表达的lncRNA在HIV-1感染中扮演着重要角色,但仅发现 lncRNA GAS5(long noncoding RNA growth arrest-specific transcript 5)在HIV-1感染后表达下调,尚无GAS5参与HIV-1复制的相关研究报道,且GAS5参与HIV-1复制的分子机制也不清楚。目的:初步探讨GAS5在HIV-1NL4-3病毒复制中的作用与功能,为未来设计治疗HIV-1病毒感染的药物或疫苗提供实验依据与新的思路。方法:将 pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-)-GAS5、GAS5-siRNA-1/2、NC-siRNA、pNL4-3.Luc.R-E-以及内参质粒pRL-TK、辅助质粒pVSV-G共转染至293T细胞或Jurkat细胞,待48h后,利用双荧光素酶报告基因检测实验(Luciferase)初步检测GAS5过表达质粒,GAS5-siRNA-1/2对HIV-1NL4-3基因的影响;利用荧光实时定量PCR实验(RT-PCR)检测GAS5过表达质粒、GAS5-siRNA-1/2对HIV-1NL4-3 gag和pol基因的mRNA表达水平的影响;利用免疫印迹实验(Western bloting)检测GAS5过表达质粒、GAS5-siRNA-1/2对HIV-1 p24蛋白和Tat蛋白表达水平的影响;通过生物信息学软件Genomica、starBase v2.0对GAS5与可能相互作用的microRNA进行预测,找到GAS5与miR-873可能的结合序列,进一步按照pmirGLO表达载体说明书要求,将设计合成的预测结合片段序列miR-873-WT及突变的错配序列 miR-873-Mut 连入 pmirGLO 表达载体,得到 pmirGLO-miR-873-WT 和pmirGLO-miR-873-Mut 报告质粒。将 GAS5、pmirGLO、pmirGLO-miR-873-WT、pmirGLO-miR-873-Mut 与内参质粒 pRL-TK 共转染 293T 细胞,48h 后,利用 Luciferase实验初步检测GAS5对miR-873的影响,并用RT-PCR实验进一步验证GAS5对miR-873的影响。方法同前,将 pHage-miR-873、Inhibitor-miR-873、pNL4-3.Luc.R-E-等共转染至 293T细胞或 Jurkat细胞,待48h后,利用 Luciferase实验初步检测 miR-873,Inhibitor-miR-873对 HIV-1NL4-3基因的影响;利用 RT-PCR 实验检测 miR-873,Inhibitor-miR-873 对HIV-1NL4-3 gag和pol基因的mRNA表达水平的影响;利用Western bloting实验检测miR-873、Inhibitor-miR-873 对 HIV-1 p24 蛋白表达水平的影响。结果:(1)在293T细胞中,Luciferase实验结果表明,GAS5对HIV-1NL4-3基因有显著的抑制作用(P<0.05);在Jurkat和293T细胞中,RT-PCR实验结果表明,GAS5能够明显地降低HIV-1NL4-3 gag和pol基因的mRNA表达水平(P<0.05);Western blotting实验结果表明GAS5能够显著降低HIV-1 p24蛋白和Tat蛋白的表达水平(P<0.05)。(2)在293T细胞中,Luciferase实验结果表明,GAS5与miR-873预测的结合位点存在相互作用(P<0.05);在Jurkat和293T细胞中,RT-PCR实验结果表明,GAS5能够降低miR-873基因的表达(P<0.05)。(3)在293T细胞中,Luciferase实验结果表明,miR-873可以促进HIV-1NL4-3基因的表达(P<0.05);在Jurkat和293T细胞中,RT-PCR实验结果表明,miR-873能促进HIV-1NL4-3 gag和p l基因的 mRNA 表达水平(P<0.05);Western blotting 实验结果表明,miR-873能促进HIV-1 p24蛋白的表达水平(P<0.05)。结论:GAS5对HIV-1NL4-3有明显的抑制作用,其可能是通过抑制miR-873来实现。