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果糖激酶(Fructokinase,FRK)能磷酸化果糖,是果糖分解代谢途径中很关键的一类酶,广泛存在于细菌和动植物中。研究发现,植物FRK家族基因在其正常生长发育和逆境适应中都具有重要的生物学功能。目前,有关水稻OsFRK家族基因的表达特性和生物学功能研究的报道数量有限。本研究基于生物信息学手段,鉴定出5个水稻OsFRKs,分别命名为OsFRK1～OsFRK5,分析了其结构特点、系统发育树和表达特性等;以粳稻中花11(ZH11)为材料,利用RT-PCR法克隆了OsFRK1～OsFRK3,基于qRT-PCR法分析了OsFRK1～OsFRK3在水稻中的表达特点;采用CRISPR/Cas9等技术获得了OsFRK1～OsFRK4的T!代单基因敲除纯合突变体,并对其部分发育表型性状进行了分析。为进一步研究OsFRK家族基因在水稻生长发育与逆境适应中可能具有的生物学功能奠定了重要基础。主要研究结果如下:1.水稻OsFRKs的主要特征特性基于生物信息学分析发现,5个水稻OsFRKs都具有果糖激酶特有的ATP结合位点和底物识别位点,OsFRK1～OsFRK3可分一个亚家族,OsFRK4～OsFRK5可分为另一个亚家族;5个水稻OsFRKs分布于第1、3、6和8号染色体上,基因大小为2770～6214bp,分别含有2～7个外显子,编码323～589个氨基酸,蛋白分子质量为34.72～65.55 kDa,等电点为5.02～6.60;这5个水稻OsFRKs皆可能在质体中表达,其中OsFRK1还可能在细胞质和线粒体中表达;这些水稻OsFRKs的启动子序列中含有多种与发育、逆境胁迫和激素响应相关的顺式作用元件,暗示它们应该在水稻的生长发育与逆境适应中具有重要作用。2.正常条件下OsFRKs在水稻不同组织部位中的表达模式基于生物信息学分析的组织特异性表达谱结果显示,水稻OsFRKs皆为组成性表达,其中OsFRK4与OsFRK5的表达模式极为相似。然而,基于qRT-PCR法检测结果表明,OsFRK1～OsFRK2和OsFRK4～OsFRK5均为组成性表达,但OsFRK3却为特异性表达(仅在根茎叶中表达);其中,OsFRK1和OsFRK3在第三叶(L3)中表达量最高,而OsFRK2在幼苗根中的表达量更为显著。3.创建了OsFRK1～OsFRK4的T1代单基因敲除纯合突变体利用CRISPR/Cas9技术成功创建了OsFRK1～OsFRK4的To代敲除突变体,其突变率分别为46.4%、92.9%、93.3%和66.7%,经世代分离和分子鉴定后,我们分别获得了 6种(OsFRK1)、6种(OsFRK2)、10种(OsFRK3)和6种(OsFRK4)不同突变类型的Ti代敲除纯合突变体,这4个OsFRKs基因突变后所编码的氨基酸功能结构域序列都遭到破坏或翻译发生过早提前终止现象,只是OsFRK2和OsFRK3的部分突变体存在脱靶现象,后续实验应挑选无脱靶现象的纯合突变体进行,或通过设计新的靶位点,重新创建无脱靶的敲除纯合突变体进行后续实验。4.水稻OsFRK1～OsFRK4敲除纯合突变体的部分发育表型分析本研究对T1代敲除纯合突变体的农艺性状进行考察发现,水稻OsFRK1对水稻的株高、穗长、结实率和千粒重等农艺性状可能没有影响,但OsFRK2和OsFRK3却对水稻主穗的结实率和千粒重有明显的影响,说明OsFRK2和OsFRK3很可能在水稻穗部性状发育中具有重要作用。而OsFRK4的T1代敲除纯合突变体存在明显的白化致死表型,说明OsFRK4对水稻叶绿体的正常发育很可能是必需的。此外,本研究对水稻OsFRK2的T2代敲除纯合突变体的幼苗生长进行观测发现,突变体的根和根上部分的生长势都比野生型差很多,说明OsFRK2很可能在水稻幼苗的生长发育中具有十分重要的作用,但有待进一步实验证实。