随着全球变暖和生态环境的恶化,干旱和低温等极端天气越来越常见,极端外界环境对作物产量和品质造成了严重影响。逆境胁迫对植物生长造成严重危害,引发植物一系列生理生化功能紊乱和形态改变。应对这样的不良环境,植物也进化出一系列抵御不良环境的逆境应答机制,例如激素信号转导系统、SOS系统和抗氧化防护系统等。磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）是植物抵御非生物胁迫的重要酶类。PLD水解膜磷脂产生磷脂酸（Phosphatidic acid,PA）,PLD/PA共同参与调控多种胁迫应答过程,因此深入揭示PLD/PA调控植物耐渗透胁迫的分子机制,对于农作物的抗逆分子遗传改良具有重要的意义。拟南芥基因组有12个PLD基因,根据蛋白结构和催化区域,分为PLDα（3）、PLDβ（2）、PLDγ（3）、PLDδ、PLDε 和 PLDζ（2）。其中,PLDα1 和PLDδ含量最多。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,研究PLDα1和PLDδ对渗透胁迫下植物保卫细胞内钙信号以及气孔开度的影响。本课题组前期实验已确定NaCl、脱落酸（Abscisic acid,ABA）和 PA 处理野生型（Wild type,WT）和pldα1突变体幼苗后,WT钙离子浓度显著高于pldα1突变体;pld突变体中PLDα1基因的缺失引起植物体内PLD蛋白活性显著降低,而PLDα1和PLDδ基因双敲除突变体PLD活性更低;ESI-MS/MS测定结果表明pldα1 pldδ突变体中PA含量显著降低。本文研究发现,山梨醇处理拟南芥幼苗,WT气孔关闭,而pldα1 pldδ-1和pldα1pldδ-2双突变体气孔不关闭。利用钙离子专一性染料Fluo-3处理拟南芥幼苗后,再用300 mM山梨醇处理拟南芥幼苗,激光共聚焦显微镜观察发现,WT保卫细胞中的钙浓度显著上升,而pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2中钙离子浓度变化幅度相对较小。利用DAB对拟南芥幼苗进行处理,结果发现山梨醇处理后的WT和pldα1 pldδ-和pldα1 pldδ-2保卫细胞中H2O2浓度均升高,且突变体中的H2O2含量低于野生型。利用过氧化氢染料H2DCF处理拟南芥表皮条,激光共聚焦显微镜观察显示,随着山梨醇处理时间的增加,WT和pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2突变体中H2O2的含量逐渐接近,处理15min后WT与pldα1 pldδ-1、pldα1 pldδ-2突变体中中的H2O2的含量几乎相当。利用H2O2染料H2DCF处理拟南芥表皮条,激光共聚焦显微镜观察显示,随着山梨醇处理时间的延长,WT和pld突变体中H2O2浓度随之升高且逐渐接近,处理5 min后pldα1 pldδ-1、pldα1 pldδ-2突变体保卫细胞的H2O2含量只有110左右,是WT保卫细胞的2/3;而处理15 min后,WT和pldα1pldδ双突变体的H2O2浓度几乎相当。200mM sorbitol处理WT和pldα1 pldδ双突变体,突变体主根生长明显被抑制。实验结果表明PLDα1和PLDδ基因的缺失大大降低了拟南芥保卫细胞和主根对渗透胁迫的敏感性,PLDα1和PLDδ参与渗透胁迫下拟南芥保卫细胞钙离子和H2O2的释放,进而调控气孔关闭。拟南芥OSCA1.1被确定为质膜渗透压控制的非选择性钙离子通道。前期实验已证明OSCA1.1参与山梨醇诱导的拟南芥气孔运动,且在植物的花、茎、叶、种子中均有表达。本课题为了探究拟南芥OSCA1亚家族各基因的功能及其相互之间的关系,提取了拟南芥OSCA1亚家族OSCA1.1～OSCA1.8在内的八个成员的基因和蛋白序列。通过生物信息学分析发现该亚家族基因分别位于拟南芥10条染色体中的三条上。且这八个成员结构高度保守,均含有胁迫相关顺式作用元件,暗示拟南芥OSCA1亚家族在帮助植物抵御干旱、冷害、盐胁迫等逆境方面发挥重要作用。通过GEO网站提取渗透胁迫处理后的拟南芥各组织部位OSCA1亚家族各基因表达量并绘制热图,结果表明,OSCA1.1、OSCA1.2以及OSCA1.8在渗透胁迫下有较高的表达量,而OSCA1.4和OSCA1.5的表达量较低。利用三引物法和RT-PCR技术鉴定出osca1.1和osca1.2纯合突变体,山梨醇处理后发现两者气孔均不关闭,且外源PA的添加不能恢复osca1.1和osca1.2的气孔关闭。利用脂印迹（Fat-blot）实验技术发现PA与OSCA1.1和OSCA1.2蛋白特异性结合与OSCA1.8不结合。利用点突变技术确定PA与OSCA1.1和OSCA1.2蛋白结合位点均为第743位的赖氨酸和744位的精氨酸。因此我们推测,OSCA1家族基因响应渗透胁迫,PA是调控该信号通路的重要信号分子。