狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的一种人兽共患的烈性传染病,一旦发病难以医治。准确、及时、快速的诊断是临床治疗的前提,也是免疫监测、流行病学调查的主要手段,还是有效控制狂犬病的关键。狂犬病病毒的核蛋白(Nucleoprotein,NP)是狂犬病病毒主要的结构蛋白之一,其编码基因也是最保守的基因,且抗原表位相对集中,因此,是检测狂犬病病毒的首选抗原之一。　　 本研究以RV HEP-Flury株的N基因为参考模板,选取基因中抗原表位富集区基因,根据表达宿主菌E.coll BL21(DE3)pLysS对三联密码子的偏嗜性进行修饰并合成其序列(NP),进一步将该基因片段亚克隆到表达载体pET-32a(+),构建融合表达质粒pET-32-NP,转化表达宿主菌E coll BL21(DE3)pLysS,并利用IPTG诱导表达。同时,通过PCR的方法扩增RV HEP-Flury株的N基因的相同部位的抗原富集区基因片段克隆到表达载体pET32a(+),构建融合表达质粒pET-32-N,转化表达宿主菌E coli BL21(DE3)pLysS,并利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blotting和薄层扫描分析结果显示,表达的蛋白均具有良好的反应原性和特异性,通过密码子优化,pET-32-NP的表达量比pET-32-N明显提高。对NP重组蛋白大量诱导表达,利用HisTrap FF亲和柱对表达的蛋白进行纯化,使用超滤离心管对纯化的NP重组蛋白进行浓缩和脱盐,获得高纯度的糖蛋白。　　 本研究以纯化的NP重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,200μg/只,共免疫4次。断尾采血,建立间接ELISA方法测定血清抗体效价。取血清效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000的作用下进行细胞融合。用HAT选择培养基对杂交瘤细胞进行培养,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆,重复4次,获得了1株能稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(分别命名为5-D3)。将阳性杂交瘤细胞注射BALB/c小鼠制备腹水,测定腹水效价在1:105以上。杂交瘤细胞株连续培养30代以及冻存3个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFAT)和Western-blotting检测结果显示,该株单抗的腹水均能特异性识别NP重组蛋白与RV病毒,与犬六联苗(包括犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒Ⅰ/Ⅱ型和犬钩端螺旋体)无交叉反应。　　 本研究在成功表达INP的抗原富集区基因的基础上,对N基因一段抗原表位富集区基因的稀有密码子序列进行了分析和优化,提高N基因在原核细胞中的表达水平;获得了稳定、特异、高效的单克隆抗体,为狂犬病及狂犬病病毒的快速检测技术及相关研究奠定了良好的基础。