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玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是一种世界性分布的重要丝状病原真菌,由其引起的玉米大斑病是一种重要的叶部病害,流行年份造成严重的经济损失。了解病菌的致病分子机理对其病害的有效防治具有重要意义。众所周知,鉴定病菌致病相关基因是了解病菌致病机理的关键,许多致病相关基因是通过DNA插入产生致病缺陷突变而分离得到的。目前,REMI已经广泛应用于动植物病原真菌以及其他真菌的研究。近10年来,我们利用REMI技术已成功克隆了某些病原菌的致病相关基因。限制性内切酶介导整合转化(restriction enzyme-mediated integration,REMI)正被越来越多地应用于丝状真菌致病相关基因的标记与克隆。本研究在本实验室前期建立的转化体系的基础上,继续优化转化条件,发现玉米大斑病菌菌体的培养时间、细胞壁降解酶的种类、酶解时间、酶解温度以及再生培养基等一系列因素对原生质体释放及再生有明显的影响。原生质体制备的最佳条件是将玉米大斑病菌的分生孢子在Fries液体培养基中培养20 h,选择1%崩溃酶、1%溶壁酶和1%蜗牛酶的酶组合,30℃酶解4～5 h,酶解过程中用NaCl作缓冲体系的稳渗剂,原生质体浓度可达到10~6个/mL以上。冰浴时间以15 min为最佳,此时转化效率较高。原生质体与加入质粒的比例对转化效率影响很大,加入质粒的比例过低转化率明显降低,而过高又会影响原生质体中插入质粒的拷贝数。利用REMI技术转化玉米大斑病菌野生菌株01-23,共获得了310个玉米大斑病菌REMI转化子。将这些转化菌株在含50μg/mL潮霉素的PDA培养基上培养5代(无性繁殖)均能生长,表明所有转化子各子代均具有潮霉素抗性,而野生菌株01-23不能生长,说明转化子在遗传上是稳定的。对这些突变体的基因组进行了PCR扩增,发现所有参试基因组中都能扩增到潮霉素磷酸转移酶基因(hph)序列,表明突变体的基因组中确实己经携带hph基因序列。通过Southern blotting对PCR检测阳性的转化子进行了拷贝数验证,发现转化子M142为单拷贝突变体,对转化子M142进行致病性分析,发现其致病力减弱,且孢子形态发生了较大变化。