小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫。冬虫夏草菌侵入宿主蝠蛾幼虫后，要在其血腔中共存长达5～12个月，最终幼虫死亡而形成僵虫。此感染过程明显不同其它常见病原真菌（如白僵菌、绿僵菌、蛹虫草菌）数天致死昆虫的过程。因此，宿主蝠蛾感染冬虫夏草菌是非常独特的昆虫-真菌互作的研究模型，两者互作机制的解析，将扩展人们对这种高经济价值昆虫基础生物学知识的了解。但是，有关蝠蛾与冬虫夏草菌长期互作分子机制的研究非常匮乏。本课题中，建立了4类蝠蛾幼虫应激模型，即生理盐水(Ringers，RS)的应激、冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis，Os)的应激、病原真菌蛹虫草(Cordyceps militaris，Cm)的应激和病原细菌阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae,Ec）的应激。首先，利用第二代测序技术和生物信息学手段，了解蝠蛾应对不同外源刺激的基本响应特征。接下来，通过保守结构域分析、序列比对、进化分析及基因表达信息比较，构建蝠蛾免疫调控网络。在此基础上，比较分析不同应激状态下，蝠蛾抗真菌免疫元件的诱导表达谱，进而探究蝠蛾-Os互作的分子机制。论文主要研究内容、结果总结如下:　　1.蝠蛾转录本数据库的构建　　使用Hiseq2000结合454的测序方法，建立高质量小金蝠蛾转录本数据库，其中包含50，164条序列，N50=1，357bp。对健康小金蝠蛾、感染Os后12、48、72小时(hours，h)、1年的小金蝠蛾、感染Cm后12h、48h、72h的小金蝠蛾、感染Ec后6h的小金蝠蛾，以及RS刺激的小金蝠蛾脂肪体组织，分别在Hiseq2000平台进行转录组测序。将上述10个文库获得的读段混合后进行从头拼接，得到197，080转录本，此数目远远高于已知的其他测序物种的转录本数目。为提高拼接序列质量、降低冗余，实验引入454测序，并进行二次拼接，最终产生50，164条转录本，且长度在500～2000bp的序列数目显著增加。说明对于无参考基因组的物种，可选用Hiseq2000结合454的测序方法，在保证测序的深度和覆盖度的同时，能够有效延伸拼接序列长度、降低冗余，从而构建高质量转录本信息库。　　2.蝠蛾针对不同外源刺激的基本响应特征　　RS、真菌Os、真菌Cm、细菌Ec侵入会诱发蝠蛾产生不同的应激反应，且免疫功能类基因是蝠蛾差异响应不同刺激的关键基因群之一。虽然在表型上，RS、Os处理组蝠蛾没有明显的病症表现，而Cm、Ec处理组蝠蛾行动缓慢、体色加深有明显的病症表现，但是在转录水平上，4种外源刺激均会诱发蝠蛾发生剧烈变化，即4个处理组蝠蛾均有一定数量显著诱导表达基因。其中，4种外源刺激特异诱导基因数目占差异表达基因总数的50％，预示蝠蛾对RS、Os、Cm、Ec入侵的响应存在显著差异。另外，对感染Os后不同时相的蝠蛾转录组数据分析发现，虽然在侵染的不同时间点，Os诱导宿主幼虫上调表达的基因，在各项生理功能均有分布，但是该真菌同样会诱导蝠蛾一定数量的执行各种功能的基因下调表达。正因如此，蝠蛾各代谢活动不致过分激活，保证各项生理功能的动态平衡。为进一步探究蝠蛾差异响应不同外源刺激的原因，对特异诱导表达基因进行功能富集分析发现，免疫功能组活跃基因比例最高，提示蝠蛾差异响应不同刺激可能与其免疫系统的应答机制有关。　　3.蝠蛾免疫系统的组成　　蝠蛾免疫系统组成完善，没有明显的免疫元件缺失现象。依据已知其它昆虫免疫相关基因序列，自蝠蛾转录本数据库中鉴定到免疫相关基因287条，并将其按功能分组，具体包括外源物识别、信号调控、信号转导及效应分子等。其中，蝠蛾C-type lectin domainprotein(CTLDP)和clip-domain serine protease(cSP)家族有明显的基因扩增现象。另外，相对于其它昆虫，蝠蛾AMPs的种类及数目较少，暗示小金蝠蛾可能通过扩大AMP抗菌谱的策略来抵御不同外源微生物的侵扰。　　4.昆虫免疫系统的进化　　昆虫参与免疫反应的胞外元件与胞内元件具有不同的进化模式。对多物种免疫基因家族进行系统进化分析发现，执行识别（如肽聚糖识别蛋白、CTLDPs）、效应分子（如抗菌肽attacins、cecropins）以及胞外信号调控的元件多发生基因扩增、变异。推测，这与其位于胞外所处环境相对多变，且通常需要与种类多样的入侵外源物直接接触相关。相比之下，昆虫胞内的信号转导元件高度保守;蝠蛾及多数其它昆虫基因组中编码胞内免疫信号传递元件的基因仅含一个拷贝，且相互之间同源，提示昆虫间胞内免疫通路信号传递的分子机制相似。　　5.蝠蛾免疫系统的调控机制　　对免疫相关基因的诱导表达谱进行比较分析发现，蝠蛾Toll、IMD(immunedeficiency)、JNK(Jun-N-terminal kinase)、JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer andactivators of transcription)免疫通路，以及酚氧化酶原(prophenoloxidase，PPO)激活级联反应，以不同的调控机制响应不同类型的外源刺激。蝠蛾Toll通路能够快速并持续的激活，来应对真菌相对漫长的感染过程。蝠蛾IMD通路主要应对细菌入侵类型的急性感染过程;该通路中多个信号传导抑制元件会在RS和真菌Os、Cm入侵的蝠蛾幼虫中上调表达，提示在应对损伤以及真菌长时感染的刺激时，蝠蛾IMD通路激活的时长和强度会受到限制。激酶JNK仅在RS刺激的幼虫脂肪体中上调表达，进而诱导下游转录因子Fos也随之过表达;在真菌Os、Cm及细菌Ec处理组中，虽然Fos诱导上调表达，但是通路中其他成员（比如TRAF1、Msn、Hep、JNK和Jra）的表达量不变或下调表达，因而推测，JNK信号转导途径不参与蝠蛾抵御病原菌侵染的免疫反应。调控下游效应基因表达的转录因子STAT的表达量在各蝠蛾处理组中均较低，因此JAK/STAT通路在蝠蛾免疫防御体系中的作用有待进一步检测。蝠蛾参与PPO激活级联反应的若干cSPs能够强烈激活以应对真菌和细菌的入侵。　　6.蝠蛾-Os长期互作的分子机制　　真菌Os以免疫逃逸和免疫抑制两种策略，使宿主蝠蛾免疫耐受该真菌侵染。如此，蝠蛾不会经受因免疫系统反应过激所带来的损害，进而长期与Os共存。利用免疫荧光法观察发现，小金蝠蛾能够通过模式识别受体βGRP1识别真菌Os、Cm。但是，在Os感染后期，虽然βGRP1在转录水平上仍有较高表达丰度，但是其蛋白无法结合至该真菌表面，同时Toll通路相关基因以及下游效应基因也处于低表达状态，暗示Os入侵蝠蛾一段时间后，可能对自身进行某些改造以躲避宿主Toll通路系统的监测。通过免疫印迹实验发现，Cm/Ec的侵入，诱导蝠蛾血淋巴内PPO和PO(phenoloxidase)含量显著升高，而Os的侵染对PPO/PO的诱导不明显。考虑到PPO激活级联反应上游元件(cSPs)，在Os/Cm/Ec处理组中均普遍上调表达，因此推测，Os入侵蝠蛾后会分泌抑制因子阻碍PPO的诱导和切割激活。　　7.蝠蛾CTLDP家族成员的比较分析　　CTLDP不同亚族间的进化模式、序列结构以及执行功能均存在差异。蝠蛾转录本数据库中，含有32条CTLDP基因。根据结构域的组成，将蝠蛾CTLDPs分为3个亚族。系统进化分析发现，CTL-S和CTL-X亚族成员相对保守，不同物种的同源CTL-Ss/CTL-Xs能够形成单系群;IML亚族成员变化较大，其通过基因复制、融合形成两个串联的CRDs，并且在自然选择压力下，发生亚族基因扩增现象。对蝠蛾53个CTLDs进行序列比对，结果显示不同亚族成员的二硫键数目和Cys-4后的氨基酸残基有不同特征。参考已有研究，同时结合系统进化分析和蝠蛾CTLDP基因的诱导表达谱，推测蝠蛾CTL-Ss和CTL-Xs可能主要参与内源多糖的结合或细胞粘连、组织联结过程，蝠蛾IMLs可能是其免疫系统的重要识别受体。其中，IML亚族内不同成员在响应不同外源刺激时有不同的调控机制;IML14和IML8可能参与蝠蛾差异响应真菌Os、Cm的防御反应，两者的功能值得进一步探究。　　综合来讲，本课题借助高通量二代测序技术，完成了蝠蛾转录本信息库的构建填补了蝠蛾属昆虫遗传信息的空白。通过比较分析处理/对照组蝠蛾转录据数据，明确了蝠蛾在不同应激状态下的响应特征，并且发现免疫相关基因的调控差异是蝠蛾差异响应不同外源刺激的关键。通过序列相似度分析，得到大量蝠蛾免疫相关基因，同时结合这些基因的诱导表达谱，明确了蝠蛾免疫调控网络。在此基础上，比较分析了Toll通路、PPO激活级联反应以及IML亚族相关基因在不同处理组蝠蛾中的表达变化。上述结果，为后续解答Os长期感染蝠蛾的分子机制提供线索，同时也将为人工培育冬虫夏草提供理论指导。