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泡桐丛枝病是由植原体引起的一种传染性病害,不仅给泡桐生产造成巨大的经济损失,而且也严重影响人们种植泡桐的积极性。泡桐丛枝病是我国林业生产中亟需解决的问题之一,在过去的40多年中,科研工作者对泡桐丛枝病和植原体两方面进行了研究,首先,科研人员进行大量的生理生化及相关基因表达的研究,对丛枝病植原体也开展了病原的传播途径,分类,繁殖方式等研究工作,但是丛枝病的发病机理仍不清楚。在本研究中,以白花泡桐、毛泡桐以及杂交种豫杂一号泡桐的健康苗、丛枝病苗和用15mg·L-1硫酸二甲酯(Dimethyl sulphonate,DMS)甲基剂处理的病苗为实验材料,成功的构建了9个sRNA文库(PF、PFI、PFI-D15、PT、PTI、PTI-D15、PTF、PTFI、PTFI-D15)并进行了测序分析。在观察幼苗形态变化的同时,从分子生物学水平研究了植原体侵入对白花泡桐,豫杂一号泡桐和毛泡桐基因表达的影响。现将结果归纳如下: (1)对3个种泡桐的9个sRNA文库进行了测序,每个样品均测到近1千万条raw reads序列。利用生物信息学软件分析后,然后分别得到Valid reads(PF)11378626条,(PFI)10311261条,(PFI-D15)7447741条,(PI)7283265条,(PTI)8660319条,(PTI-D15)6784031条,(PTF)10376326条,(PTFI)6791333条,和(PTFI-D15)7698718条泡桐基因组序列。 (2)对9个泡桐基因组文库进行Illumina高通量测序,将sRNA序列比对到泡桐基因组上,全面系统地比较了各个类型sRNA序列的种类和数量,共获得到了519个mRNA。其中,白花泡桐共鉴定出206个保守miRNAs和122个新型miRNAs;毛泡桐共鉴定出295个保守miRNAs和156个新型miRNAs;豫杂一号泡桐共鉴定出291个保守miRNAs和140个新型miRNAs。 (3)由比对方案挑出3个泡桐种共有表达差异mRNAs27条(保守miRNAs和新型miRNAs序列分别为23条和4条)。白花泡桐和毛泡桐共有差异miRNAs序列56条(46条保守miRNAs和10条新型miRNAs),杂交种豫杂一号泡桐鉴定的miRNA数量和成员与其亲本有所不同,豫杂一号泡桐和父本白花泡桐共有差异miRNAs51条(保守miRNAs40条和新型miRNAs11条),与母本毛泡桐共有差异miRNAs106条(保守miRNAs85条和新型miRNAs21条)。通过对比这3个种之间获得的差异miRNA靶基因的功能,发现这三个种间共有的27个miRNA在丛枝病发生过程中起重要作用。 (4)利用降解组测序技术对3个种泡桐的miRNA进行了靶基因的鉴定和分析。此外,对差异表达的miRNA的靶基因进行了GO功能注释分类和KEGG代谢途径富集分析。发现与植原体胁迫及其形态变化相关的miRNA的靶基因的功能主要涉及其他次生代谢产物的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites)、其他氨基酸代谢(Metabolism of other amino acids)、细胞生长和凋亡Cell growth and death)、免疫系统(Immune system)、外源物质的生物降解和代谢(Xenobiotics biodegradation and metabolism)等代谢途径。 (5)从这些差异miRNA及其靶基因中,挑出7个差异miRNAs和4个靶基因进行qPCR验证,结果显示qPCR的结果与测序结果分析一致,该结果充分肯定了测序结果的正确性及可靠性。