目的:白介素-10(IL-10)是一个对大多数造血细胞系发挥多向作用的多功能细胞因子。IL-10具有限制和终止炎症反应、调节免疫反应的功能。克隆化人IL-10基因及重组蛋白的制备为研究HI-10基因表达在小儿炎症性、过敏性疾病中的作用,治疗性临床应用等提供坚实的基础。 方法:采用过敏症病人发作时期的外周血,在外周血单核细胞较高水平表达IL-10的时期,分离全血单个核细胞,提取总RNA。以总RNA为模板,根据人IL-10在GenBank中的全长开放读框设计的特异性引物进行反转录,RT-PCR进行IL-10基因筛选。PCR产物经酶切分析和DNA序列测定后;构建重组质粒pcDNA4/HisMax-IL10,能够较高效率地在哺乳类动物细胞中进行表达,可用于非病毒载体转基因的实验研究。 利用分子杂交技术,将克隆化的IL-10基因通过亚克隆技术构建了pTrehHis2B-hlL10原核高效表达载体,通过工程菌JM109经IPTG诱导表达重组hIL-10蛋白,并经与Ni-NTA树脂中的6×His配体结合进行亲和层析纯化,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。 结果:RT-PCR产物经限制性酶切分析和DNA测序,克隆化人IL-10全长开放读框完整,序列准确无误。酶切分析和DNA测序显示外源基因在重组载体中的插入方向正确,表达读码框正确。SDS-PAGE分析显示;原核表达系统表达的重组蛋白量和纯度满意。 结论:采用以总RNA为模板的RT-PCR一步法,能简便、可靠地获得hIL-10基因产物,所构建的原核表达载体pTrcHis2B-hIL10,能够快速、高效制备rhIL-10蛋白,为细胞因子hIL-10功能的进一步研究及临床应用奠定了基础。