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作为基因转移的载体,腺联病毒(adeno-associated virus, AAV)具有外源基因表达稳定、感染细胞类型多、无致病性、免疫原性低等优点,重组AAV载体在基因治疗研究中受到越来越多的重视。目前对于AAV基因组复制的研究较为详细,但病毒装配的研究很少。AAV基因组由分别编码非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap的开放阅读框(ORF)组成,其中Cap基因有两个ORF, ORF1编码衣壳蛋白、VP1、VP2和VP3,VP3为病毒衣壳的主要成分,也是决定AAV血清型的主要蛋白质；ORF2编码病毒装配活性蛋白(AAP)。本研究主要为进一步研究AAV各亚型和VP3蛋白之间的关系提供有效的生物工具。本研究以含有5型AAV Cap基因的质粒(pAAV5-2)为模板,PCR扩增5型腺联病毒AAP编码序列(AAP5)；以pCRAAAV为模板,PCR扩增禽腺联病毒VP3编码序列(AVP3),将扩增的目的片段分别插入原核表达载体pET-30a,进行原核表达。SDS-PAGE分析结果表明表达的AAP5蛋白为预期的44KD,主要存在于重组菌裂解物离心后的上清中；AVP3蛋白为预期的81KD,主要以包涵体形式存在。用镍柱亲和层析法分别从重组菌裂解物纯化得高纯度的AAP5蛋白和AVP3蛋白,并分别免疫小鼠,每次免疫后采血分离血清,以重组蛋白AAP5和AVP3为包被抗原,用方阵试验确定最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数,用建立的间接ELISA对免疫小鼠血清进行检测。结果显示：3次免疫小鼠血清的抗体效价分别为1：102400和1：51200。将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA筛选杂交瘤细胞阳性克隆,再用有限稀释法进行亚克隆,经过三次亚克隆后,两种蛋白分别获得两株稳定分泌AAP5和AVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。再以重组AAP5和AVP3为抗原,各用AAP5和AVP3杂交瘤细胞培养上清进行Western Blotting检测,结果显示分泌的单克隆抗体都能与相应的免疫原AAP5蛋白或AVP3蛋白发生特异反应。分别用两株分泌AAP5单抗的杂交瘤细胞和两株分泌AVP3单抗的杂交瘤细胞注射小鼠,收集腹水进行抗体效价测定,结果显示AAP5腹水单抗的ELISA效价分别为216和218,AVP3腹水单抗的ELISA效价分别为29和29。