野葛异黄酮生物合成途径中关键转录因子的克隆和功能研究

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野葛[Pueraria lobata(Willd.) Ohwi]是多年生豆科植物,其块根是传统中药葛根,葛根的主要有效成份是属于异黄酮类的葛根素(Puerarin),在临床上广泛应用于治疗心脑血管疾病。目前葛根素的生物合成途径和调控机理还是未知的,阐明葛根素合成相关基因特别是调控基因的功能,将有助于揭示野葛异黄酮合成的调控机理,并有望应用于以提高葛根素含量为目的的遗传工程改良。  本试验首先通过HPLC分析比较了两种野葛材料的根提取物的成分,发现葛根素仅在野生葛根中积累,另一种商业种子来源的野葛中没有积累。本文利用这两种材料的根分别进行了转录组测序,共获得了88,398个重叠群(contigs),其中野生野葛和商业野葛分别有60875个和63215个重叠群,两种野葛共有的重叠群有38040个。与野生野葛相比,商业来源的野葛中下调的基因共有5938个,上调的有9713个。  本研究重点对野葛转录组测序数据中预测的105个MYB型、111个bHLH型和143个WD40型的转录因子进行了系统的序列和进化分析。对其中一个MYB型的转录因子PlMYB1的基因研究发现,该基因与拟南芥中调控单宁生物合成的TT2基因的相似性是63%,该基因无内含子,编码区序列长度是657bp,编码219个氨基酸组成的多肽。虽然PlMYB1不能互补拟南芥突变体tt2透明种皮的表型,但是却可以互补花青素的表型。在野生型拟南芥中过量表达PlMYB1基因的植株积累比野生型更多的花青素,特别是在拟南芥的茎基部和叶柄处,表明P1MYB1正调控花青素的合成。PlMYB1基因在不同培养条件下的表达水平与葛根素的积累是正相关的,说明PlMYB1可能参与葛根素的生物合成调控。  通过对比分析野葛的bHLH型转录因子和拟南芥的12个家族(group)的bHLH型转录因子发现,野葛中归类到与黄酮生物合成调控相关的第Ⅲ家族的有4个,分别是PlbHLH3-1,PlbHLH3-2、PlbHLH3-3和PlbHLH3-4。其中具有全长的PlbHLH3-4基因的表达量与葛根素的积累之间具有一定的正相关性,说明PlbHLH3-4可能参与调控葛根素的合成。  野葛中与拟南芥中调控黄酮生物合成的WD40型的转录因子AtTTG1相似性最高(64%)的是P1WD40-1,该基因具有保守的WD序列。同时PlWD40-1基因在商业野葛根中的表达量下调,并且PlWD40-1的表达量与葛根素的积累呈正相关关系,说明PlWD40-1可能是参与葛根素合成的关键WD40型转录因子。  综上所述,本论文中对野葛转录因子的系统分析有利于阐明野葛中葛根素合成的转录调控机制,该研究将是对异黄酮生物合成途径的有益补充,同时本研究将为利用遗传工程进行异黄酮的改良提供参考和候选基因。
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