骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是犬兽医临床上最常见关节疾病之一,其最主要的病理特征为关节软骨细胞数量的减少、胞外基质代谢紊乱、关节滑膜的炎症和软骨下骨重塑等,并最终导致犬关节变形及关节功能障碍。由于关节软骨无血管、无神经,自我修复能力差,现有的治疗手段大多以抗炎、止痛等缓解症状为主,尚无确切有效的治疗方法。研究证明,间充质干细胞（MSC）及其来源的外泌体（MSC-Exo）对软骨损伤修复有明显的效果,但具体作用机制尚不清楚。为了阐明MSC及MSC-Exo促进软骨损伤修复的机制,本试验做了以下研究:1.脂肪、骨髓和脐带三种组织器官来源MSCs及其外泌体的分离鉴定采用流式细胞术对从犬脂肪、骨髓和脐带三种组织器官分离的MSCs进行表面标记物鉴定。结果表明,脂肪、骨髓和脐带三种组织器官分离的MSCs均表达MSC表面标记物CD90、CD44和CD29,低表达白细胞表面标志物CD45,符合MSC特征。通过低温超速离心法从MSC培养上清液中分离MSC-Exo,采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法（Nanoparticle tracking analysis,NTA）和Western blot法分别检测MSC-Exo的形态结构、粒径大小及MSC-Exo特异性表面标志蛋白的水平。结果表明,从脂肪、骨髓、脐带MSCs培养上清液分离得到的三种MSC-Exos形态似杯状,粒径大小分布在40-120 nm之间,均表达特异性表面标志蛋白CD9、CD81和TGS101。以上结果提示,本试验从MSC培养上清液中所分离得到的胞外囊泡符合外泌体特征。2.三种不同来源MSC-Exos对犬软骨细胞增殖、迁移、凋亡及胞外基质代谢水平的影响为了研究MSC-Exo对OA损伤修复作用的机制,本试验首先建立了体外炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）联合肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）诱导的软骨细胞损伤模型,然后通过细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）、划痕试验、流式细胞术、q PCR和Western blot法分别检测不同来源MSC-Exos对原代犬软骨细胞增殖、迁移、凋亡及胞外基质代谢水平的影响。结果显示,50、100μg/m L浓度的三种MSC-Exos在48、72 h时间段均可显著促进软骨细胞的增殖和迁移;同时,MSC-Exos可抑制IL-1β联合TNF-α诱导的软骨细胞的凋亡;此外,IL-1β联合TNF-α作用于软骨细胞后能显著引起软骨细胞胞外基质代谢发生紊乱:包括胞外基质中II型胶原和蛋白聚糖的表达被下调,胞外基质降解酶中的基质金属蛋白酶13（Matrix metalloproteinase 13,MMP13）和蛋白聚糖酶家族中的ADAMTS-5的表达被上调,而MSC-Exos与炎性因子共同作用于软骨细胞6 h后可逆转上述结果:增加胞外基质的合成,降低降解酶的表达水平。以上结果提示,MSC-Exos能促进软骨细胞的增殖、迁移和抑制软骨细胞凋亡,此外,能正向调控胞外基质代谢水平。3.脐带间充质干细胞来源外泌体中miRNA的表达分析及miR-143促进软骨细胞损伤修复的作用机制研究参考实验室脐带组织源MSC-Exo miRNA高通量测序结果,挑选出表达量高的miR-143,探究其在软骨细胞损伤中的作用及其可能的分子机制。采用CCK-8及q PCR和Western blot研究其对软骨细胞增殖、胞外基质代谢水平的影响,进一步利用生物信息学靶基因预测软件Targetscan对miR-143潜在的靶基因及其可能的结合位点进行分析,最后通过双荧光素酶报告基因、q PCR验证靶基因。研究结果表明,转染miR-143模拟物能逆转IL-1β联合TNF-α诱导的胞外基质II型胶原和蛋白多糖表达水平的下调,同时能降低胞外基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5水平。此外,转染miR-143模拟物亦能促进正常软骨细胞的增殖。最后通过双荧光素酶报告基因和q PCR法验证了IL1RL1是miR-143的直接作用靶点。结论:本试验研究表明MSC-Exo与MSC类似,均具有促进关节软骨细胞损伤修复的作用,此外进一步在细胞及分子水平揭示了非编码RNA中的miR-143促进软骨细胞损伤修复的作用机制。提示miR-143/IL1RL1能参与到调控软骨细胞增殖及胞外基质代谢方面。