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实验目的青蒿素，是一种极有效的抗疟疾中草药。其高效、低毒的抗疟疾作用，除被广泛应用于治疗疟疾外，许多研究已经证明，青蒿素还有显著的抗肿瘤效果。本研究以青蒿素的衍生物：双氢青蒿素（Dihydroarteminin，DHA）为研究对象，研究其对人骨肉瘤细胞增殖、转移和凋亡的影响，并进行分子机制探究。实验方法及步骤体外培养人骨肉瘤细胞株（MG63，U2OS，143B和Saos2），应用不同浓度的DHA分别对其干预24h和48h，筛选出对DHA最敏感细胞株和DHA的有效浓度范围。采用多种检测技术对细胞增殖、细胞凋亡和细胞转移侵袭等进行检测，观察DHA对人骨肉瘤细胞的影响，以及分子机制探讨。实验分组：空白对照（Control组），溶剂对照（0.1%DMSO），实验组（三个不同浓度的双氢青蒿素）。主要实验步骤如下：1.细胞增殖实验：结晶紫染色法和MTT（噻唑蓝）比色，分别对DHA干预前后细胞增殖活性进行定性、定量检测；克隆形成实验检测DHA对人骨肉瘤细胞克隆形成能力的影响，结晶紫染色法指示克隆形成个数，并计算克隆形成率。筛选敏感细胞株和敏感药物浓度范围。再对选定的实验细胞进行实验处理后，用Western blotting法，检测与肿瘤细胞增殖密切相关的蛋白质标志物：PCNA、Cyclin D1、c-Myc）的表达差异。2.体外培养人骨肉瘤细胞143B，用Hoechst33258凋亡染色法和流式细胞术（FCM），观察DHA作用前后对人骨肉瘤细胞周期、凋亡发生及细胞形态的影响。用Western blotting方法检测肿瘤凋亡相关蛋白标志物：Bad、Bcl-2、cleaved-caspase-3等的表达差异。3.采用划痕愈合实验、Transwell小室穿梭实验和Transwell人工基质胶穿梭模拟实验，检测DHA处理前后人骨肉瘤细胞转移侵袭能力变化。用Western blotting法检测肿瘤转移侵袭相关蛋白质标志物：VEGF和MMP-9的表达差异。4.构建β-Catenin基因的荧光素酶报告质粒（β-Catenin-Luc，p-Top），检测DHA作用前后细胞内基因β-Catenin活性变化，用Westernblot法检测Wnt/β-Catenin信号通路中关键的调节因子：GSK-3-β，p-GSK-3-β，β-catenin，Axin，Dvl和E-Cadherin，以及靶基因：COX-2、Cyclin D1和c-Myc等的表达差异，探讨Wnt/β-Catenin信号通路在DHA作用于人骨肉瘤细胞后，对肿瘤发生、发展的影响。5.构建人骨肉瘤小鼠模型（裸鼠胫骨近端，骨膜下异位成瘤），采用口服给药，观察DHA对骨肉瘤的影响。实验结果1.四株人骨肉瘤细胞（MG63，U2OS，143B和Saos2）都表现为对DHA敏感，DHA适宜浓度范围为10～40μM。DHA处理后，细胞增殖活性显著下降，克隆形成能力受抑制，且有随着浓度增加和作用时间的延长而药物干预效应增强的变化趋势。其中，143B细胞表现更敏感，与MG63、U2OS和Saos2相比，其生物学特性理工明显（如恶性程度最高，更易发生肺转移）。因此，选择143B细胞作为后续实验用细胞，实验处理组选择高、中、低浓度的DHA依次为15μM、25μM和35μM）。肿瘤增殖相关蛋白质标志物检测结果表明，DHA有效地抑制其蛋白质表达，实验组与对照级别比较，有显著性差异（P<0.05）。2.采用Hoechst33258凋亡检测技术和细胞流式（FCM）分析方法，分别对DHA处理前后，细胞凋亡进行分析。FCM结果显示，与对照组比较，DHA处理后凋亡细胞百分比增高可达67%；Hoechst33258荧光染色结果显示，染色质凝集，胞核碎裂呈现典型的凋亡体，胞体缩小。与对照组比较，DHA处理细胞后，细胞内肿瘤凋亡相关蛋白标志物表达增加达56%。3.划痕愈合实验及人工模拟组织基质胶实验结果经DHA处理后，人骨肉瘤细胞转移和侵袭能力明显减弱，肿瘤细胞自身分泌的具有破坏组织基底膜及胶原的基质金发蛋白酶（MMP）的合成受到明显抑制；具有促进骨肉瘤转移、促进异位血管生成的血管生长因子（VEGF）表达显著降低。由此可见，DHA能有效抑制肿瘤细胞的转移和血管异位生成。4. Wnt/β-catenin信号转导通路在多种肿瘤发生、发展中发挥重要的调节作用，是诸多肿瘤相关信号通路中研究最多、较透彻的通路之一。本研究通过比较DHA干预前后Wnt/β-catenin信号通路关键的调节因子的差异表达，结果表明，Wnt/β-catenin信号转导通路对肿瘤具有促进调节作用的蛋白质因子，如β-Catenin、p-GSK-3β、Dvl和核内靶基因如CyclinD1、c-Myc、COX-2，都有不同程度的表达抑制；而对肿瘤进展负向调节的蛋白质因子，如E-cadherin和Axin，都不同程度地表达增加。由此推测，Wnt/β-catenin信号转导通路在DHA干扰人骨肉瘤发展中起到不可忽略的调节作用。5.体外实验结果DHA表现出显著的干扰人骨肉瘤生长的能力。因此，本课题通过构建人骨肉瘤小鼠移植瘤模型，口服给药，观察其对实体瘤的影响。组织病理学分析结果表明，人骨肉瘤小鼠移植瘤模型构建成功，肿瘤组织是典型的骨内瘤形态表现。肺组织切片病理分析显示，实验组小鼠未发生可见的肺转移，而对照组小鼠模型发生了可见的肿瘤转移灶，经确认是骨肉瘤。肿瘤体积变化曲线显示，实验组肿瘤体积增长速度较对照组明显受到抑制,有统计学意义（P<0.05）。实验结论双氢青蒿素，除作为一种有效的抗疟疾药外，还具有显著的抗肿瘤效应，如对宫颈癌、直结肠癌等有明显的抑制作用。本课题研究结果表明，它还具有显著的抑制人骨肉瘤细胞增殖和转移侵袭、促进肿瘤细胞凋亡的生物学效应。其中，Wnt/β-catenin信号通路在DHA干扰人骨肉瘤中起到重要的调节作用。