论文部分内容阅读
[目的]1、检测乳腺癌中CD44剪接变异体的种类及表达水平,为研究CD44分子在乳腺癌进展中的功能奠定基础。2、采用短发夹状RNA (shRNA)干扰技术沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中CD44剪接变异体的表达,并观察其对MDA-MB-231细胞生长,黏附,侵袭,迁移的影响。[方法]1、RT-PCR法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231、 MDA-MB-435(?)(?)20例原发性乳腺癌组织中CD44剪接变异体表达情况,确定这两种细胞系中CD44变异体的种类,分析其与临床病理参数之间的关系。2、以这两种细胞系和原发性乳腺癌组织中表达最高的CD44剪接变异体4(CD44s)mRNA为模板,设计、合成shRNA基因片段,构建特异的shRNA-CD44s质粒表达载体,脂质体法基因转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞。3、实时荧光定量PCR检测各实验组MDA-MB-231细胞中CD44s表达情况,观察CD44s mRNA表达是否受到抑制,应用MTT比色分析法、肿瘤细胞在细胞外基质上黏附测定法、Transwell侵袭小室法及细胞划痕法观察阻断CD44s基因表达对MDA-MB-231细胞增殖、黏附、侵袭、迁移的影响。[结果11、RT-PCR分析显示,在已知的8种剪接变异体中,乳腺癌细胞系MDA-MB-23、 MDA-MB-435和所检测的全部乳腺癌组织标本中,检测到CD44剪接变异体1、2、3、4、5、6、8,其中CD44剪接变异体4、5表达水平较高。CD44剪接变异体与临床病理参数分析显示CD44剪接变异体的种类与患者年龄、TNM分期、淋巴结转移、ER、PR表达无关。剪接变异体1和剪接变异体2mRNA的高表达与较小的肿瘤直径有关；剪接变异体4mRNA高表达与组织学高级别有关；剪接变异体2、3、6mRNA高表达与HER-2低表达相关；剪接变异体5mRNA(?)∈表达和HER-2高表达相关。2、shRNA-CD44s能明显降低CD44s基因在MDA-MB-231细胞中的表达量,抑制MDA-MB-231细胞的增殖,使细胞在细胞外基质上的黏附力下降,侵袭力增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]1、MDA-MB-231, MDA-MB-435及所检测的乳腺癌组织标本中,CD44剪接变异体为异质性表达,以CD44剪接变异体4(标准型CD44, CD44s)mRNA表达水平较高。2、CD44s分子表达水平下调可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖,使细胞在细胞外基质上的黏附力下降,侵袭力增加,CD44s基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长,黏附,侵袭有重要的作用,靶向CD44s的治疗可能成为乳腺癌基因治疗的新途径。