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目的: 肺癌是对人群健康和生命威胁极大的恶性肿瘤之一。2018年美国最新肿瘤统计表明,肺癌死亡率位居各类恶性肿瘤之首,男性约占26%,女性约占25%。肺癌按照病理类型分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC),其中NSCLC是最常见的类型,约占全部肺癌的80%~85%。肺癌在治疗方法上,有手术切除肿瘤、放疗、以铂类为基础的联合化疗以及靶向药物等手段,但肺癌患者的5年生存率仍不超过18%。因此,肺癌的防治是肿瘤领域中的重点之一,应积极开展基础理论研究,并积极探寻有效的诊治方法提高肺癌患者的生存率及生存质量。 现已有报道称,PIAS1在非小细胞肺癌中高表达,然而PIAS1如何促进肺癌的发生发展,其具体功能机制仍知之甚少。 本课题探究了PIAS1对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的具体影响,且深入探讨了其促进肺癌侵袭的具体分子机制,为非小细胞肺癌的基因治疗提供新的思路。 方法: (1)PIAS1在非小细胞肺癌组织中的表达情况: 收集宁波市第二医院胸外科手术肺癌组织及配对的癌旁组织样本,利用蛋白质免疫印迹实验验证NSCLC组织标本中PIAS1蛋白的表达情况。 (2)PIAS1对NSCLC细胞侵袭能力的影响: 利用短发夹RNA(shRNAs)在A549细胞中降低PIAS1的表达,并建立稳定转染细胞A549(shPIAS1#1)、A549(shPIAS1#2)及相应对照细胞A549(Vector)。采用Transwell实验检测PIAS1对NSCLC细胞侵袭能力的影响。 (3)PIAS1对RhoGDIβ表达水平的影响: 采用蛋白质免疫印迹实验检测PIAS1敲减细胞中RhoGDIβ、SOD2蛋白的表达水平。 (4)RhoGDIβ在PIAS1调控细胞侵袭中发挥的作用: 利用短发夹RNA(shRNAs)在A549-shPIAS1#2细胞中升高RhoGDIβ的表达,并建立稳定转染细胞A549-shPIAS1-GFP-RhoGDIβ。利用Transwell实验检测RhoGDIβ在PIAS1调控细胞侵袭过程中是否发挥作用。 (5)PIAS1如何调控RhoGDIβ: 利用RT-PCR实验,检测PIAS1是否从mRNA水平调控RhoGDIβ。利用双荧光素酶报告基因实验检测PIAS1影响RhoGDIβ转录的可能性。用RNA稳定性实验检测PIAS1是否调控RhoGDIβmRNA水平的稳定性。 (6)PIAS1如何通过AUF1调控RhoGDIβ: 我们先利用RT-PCR实验检测PIAS1是否从mRNA水平调控AUF1的变化,再利用蛋白质免疫印迹实验检测PIAS1敲减细胞中AUF1、Nucleolin和HUR的表达水平。 利用蛋白酶体抑制剂MG132使A549细胞和A549-shPIAS1细胞中AUF1蛋白蓄积,而后换入不含MG132的培养基并加入蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX),利用其半衰期设定时间点,检测PIAS1是否调控AUF1蛋白降解。 在A549-shPIAS1细胞中利用短发夹RNA(shRNAs)敲减AUF1并建立稳定转染,蛋白质免疫印迹实验检测PIAS1敲减细胞中敲减AUF1对RhoGDIβ表达的影响。 利用Transwell实验再次验证AUF1在PIAS1调控细胞侵袭过程中是否发挥作用。 结果: (1)PIAS1在非小细胞肺癌中表达明显升高: 蛋白质免疫印迹实验结果表明在大多数NSCLC组织中PIAS1的表达高于癌旁正常组织。 (2)PIAS1显著促进非小细胞肺癌的侵袭能力: Transwell实验结果表明PIAS1敲减细胞其侵袭能力明显减弱,但迁移能力变化不明显。 (3)降低PIAS1的表达能抑制细胞的侵袭能力,这是通过降低RhoGDIβmRNA水平的稳定性来实现的: RT-PCR实验结果表明PIAS1敲减细胞中RhoGDIβmRNA的表达下降。结合前文实验结果和双荧光素酶报告基因实验结果可以排除PIAS1影响RhoGDIβ转录的可能性。用RNA稳定性实验结果显示RhoGDIβmRNA降解率显著升高。 在A549敲减PIAS1细胞中过表达RhoGDIβ,可以促进细胞的侵袭能力。 (4)PIAS1在mRNA水平调控RhoGDIβ的表达: RT-PCR实验表明PIAS1从mRNA水平调控RhoGDIβ。另外,RNA稳定性实验结果显示PIAS1敲减细胞用ActD(10μg/mL)处理后,RhoGDIβmRNA的降解速率加快。这表明PIAS1通过增加RhoGDIβmRNA水平的稳定性来实现的。 (5)PIAS1通过促进AUF1的降解从而促进RhoGDIβmRNA的表达: 蛋白质免疫印迹实验结果表明PIAS1敲减细胞中Nucleolin和HUR没有明显变化,而AUF1的表达水平显著升高。 利用短发夹RNA(shRNAs)在A549-shPIAS1细胞中敲减AUF1并建立稳定转染细胞系,蛋白质免疫印迹实验结果表明A549-shPIAS1细胞中敲减AUF1可以显著上调RhoGDIβ的表达。Transwell实验表明AUF1在PIAS1调控细胞侵袭过程中发挥着关键的作用。 (6)PIAS1在蛋白降解水平调控AUF1的表达: RT-PCR实验及RNA稳定性实验表明PIAS1并非从mRNA水平调控AUF1。蛋白降解实验结果显示抑制PIAS1表达时AUF1蛋白降解速度明显减慢。 结论: 本课题率先发现PIAS1通过促进RhoGDIβ的表达,从而促进非小细胞肺癌细胞的侵袭能力。而后我们发现,PIAS1上调RhoGDIβ的表达主要是通过降解AUF1从而促进RhoGDIβmRNA水平的稳定性。总而言之,我们的数据有力地阐明了PIAS1促进非小细胞肺癌细胞侵袭能力的分子机制。