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【研究背景及目的】TNF-α是介导胆囊慢性炎症的重要细胞因子之一,而胆囊慢性炎症又是胆囊癌的主要危险因素之一。已有研究表明TNF-α可能与胆囊癌的进展有关,但具体机制不明。有报道称TNF-α在纤维母细胞及风湿病滑膜细胞中可促进VEGF-C的表达,而VEGF-C在胆囊癌中是一种重要的淋巴生成因子。本课题将研究TNF-α能否在体内外通过上调VEGF-C的表达来促进胆囊癌微淋巴管生成,并进一步探讨其分子机制。【方法】通过酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫组化法检测、分析胆囊癌胆汁标本中TNF-α、VEGF-C及组织标本淋巴管密度(LVD)之间的相关性;Real-time PCR及ELSIA法检测TNF-α对胆囊癌细胞株NOZ的VEGF-C转录及蛋白表达的影响;建立胆囊癌细胞NOZ、人真皮淋巴管内皮细胞HDLECs混合培养系统,通过淋巴小管形成试验观察TNF-α对淋巴成管的影响;建立裸鼠胆囊癌原位移植模型,制作肿瘤标本石蜡切片,免疫组化法检测TNF-α对淋巴管密度的影响;构建VEGF-C启动子双荧光报告系统,通过定点诱变、电泳迁移率变动分析(EMSA)和染色质免疫共沉淀(Ch IP)确定启动子上的NF-κB结合位点及TNF-α对启动子活性的影响。【结果】1、胆囊癌胆汁标本TNF-α浓度(609.0±43.43pg/ml)高于对照组Vs(193.3±13.47pg/ml,P<0.001);胆囊癌胆汁标本中的TNF-α和VEGF-C呈正相关(P<0.01),与胆囊癌组织的LVD亦呈正相关(P<0.01);2、TNF-α可促进胆囊癌细胞VEGF-C的m RNA及蛋白表达,并呈浓度、时间依赖性;3、体外淋巴小管形成试验中,胆囊癌细胞与HDLECs混合培养时,TNF-α处理组的小管形成数目(10.89±1.10)较TNF-α非处理组(6.82±0.62)明显增加(P<0.05),小管形成长度(10.26±1.034mm)较非处理组(6.14±0.74mm)增加(P<0.05),小管形成面积(0.86±0.04mm2)较非处理组(0.65±0.06mm2)亦增加(P<0.05);si RNA干扰VEGF-C基因的胆囊癌细胞与HDLECs混合培养时,TNF-α处理组的成管数目(4.11±0.35)较非处理组(3.44±0.29)仍升高(P<0.05),但其升高幅度(39.27%±5.60%)较对照组(71.14%±5.15%)显著下降(P<0.05),成管长度(4.34±0.24mm)与非处理组(3.48±0.43mm)无显著差异(P>0.05),成管面积(0.39±0.02mm2)与非处理组(0.33±0.04mm2)亦无显著差异(P>0.05)。4、裸鼠胆囊癌原位移植模型中,TNF-α处理组胆囊癌组织的LVD(14.33±1.17)较非处理组(10.33±1.17)明显增加(P<0.05);在si RNA干扰VEGF-C基因的胆囊癌模型中,TNF-α处理组的淋巴管密度(7.44±0.44)较非处理组(5.89±0.29)仍升高(P<0.05),但其升高幅度(26.37%±4.85%)较对照组(44.19%±3.85%)显著下降(P<0.05);5、TNF-α可激活胆囊癌细胞转录因子NF-κB,通过NF-κB与VEGF-C基因启动子的NF-κB结合位点(-315 to-306 nt,GGGGAGCTCC)结合,增加启动子活性并上调VEGF-C蛋白表达。【结论】TNF-α通过转录因子NF-κB与VEGF-C启动子的NF-κB位点相结合并上调VEGF-C启动子活性,从而上调胆囊癌细胞VEGF-C分泌,并促进胆囊癌淋巴管生成。