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猪繁殖与呼吸综合征也被称为猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起猪的病毒性传染病。感染该病毒的猪只,会出现食欲废绝、体温升高、孕后期出现莫名的流产、出生仔猪为死胎和木乃伊胎;日龄较小仔猪则表现明显的呼吸系统症状,并且会使感染PRRS的动物继发感染其他疾病尤其是细菌性疾病。1987年,蓝耳病首次被报道于美国,现在更是给全世界的养猪业造成了巨大的危害。近些年来,我国爆发和流行新型的高致病性蓝耳病,更是给养猪行业造成了严峻的打击。GP5蛋白、M蛋白是PRRSV的主要结构蛋白,也是当今国内外学者研究的热点蛋白。本试验将密码子线性优化后的GP5蛋白与M蛋白进行串联,命名为GP5/M蛋白,构建了十个带有不同可溶性标签的GP5/M重组原核表达载体,分别将其在大肠杆菌中进行表达,以表达的高可溶性GP5/M重组蛋白作为抗原,免疫家兔,探究其免疫原性。将高致病性PRRSV HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核酸序列进行密码子偏爱性优化设计,然后进行串联,命名为GP5/M蛋白。十种不同标签质粒pEX-His6-Grifin-TEV-LIC、pEX-His6-GST-TEV-LIC、pEX-His6-MBP-TEV-LIC、pEX-His6-Nus A-TEV-LIC、pEX-His6-Sumo-TEV-LIC、pEX-His6-Thioredoxin-TEV-LIC、pEX-His6-γ-crystallin-TEV-LIC、pEX-His6-Ars C-TEV-LIC、pEX-His6-Ppi B-TEV-LIC、pEX-His6-Ce HSP17-TEV-LIC分别用Nde I和Bam H I双酶切,获得Grifin(549bp)、GST(786bp)、MBP(1 236bp)、Nus A(1 617bp)、Sumo(432bp)、Thioredoxin(459bp)、γ-crystallin(666bp)、Ars C(555bp)、PpiB(624bp)、CeHSP17(513bp)十种融合标签的核苷酸序列,将十种不同可溶性标签的线性片段与表达载体pET-21b进行连接,转化,经鉴定正确后,把pET21b-Grifin、pET21b-GST、pET21b-MBP、pET21b-Nus A、pET21b-Sumo、pET21b-Thioredoxin、pET21b-γ-crystallin、pET21b-Ars C、pET21b-Ppi B、pET21b-Ce HSP17分别和GP5/M目的基因连接,构建十种重组表达载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的表达量和可溶性进行综合分析,筛选出使GP5/M重组蛋白可溶性表达水平增加的融合标签,并进行大量的诱导表达。结果显示:十种带有可溶性标签的载体,蛋白表达水平均有所提高;从蛋白可溶性水平看,除Grifin-GP5/M融合蛋白以不可溶的包涵体形式存在外,其他标签的融合蛋白可溶性表达水平均得到提高,其中MBP-GP5/M蛋白的可溶性表达水平超过了95%,所以十个标签中,MBP与GP5/M蛋白相融合的可溶性表达效果最好。十种带有不同可溶性标签的GP5/M重组蛋白通过Ni-NTAAgarose亲和纯化,并获得了高纯度的MBP-GP5/M重组蛋白质。将大批量纯化得到的MBP-GP5/M重组蛋白与等体积的佐剂乳化,制备基因工程亚单位疫苗,通过免疫家兔,检测重组蛋白的免疫原性以及刺激机体产生中和抗体的水平。综上所述,本试验成功构建了十个不同融合标签的GP5/M表达载体;建立了稳定获得GP5/M重组蛋白质的试验方法;初步鉴定了重组蛋白的免疫效力;为PRRSV亚单位疫苗的后续研究奠定了试验基础。