论文部分内容阅读
研究背景及目的:吉兰巴雷综合征（Guillain-Barrésyndrome,GBS）是以周围神经系统（peripheral nervous system,PNS）的髓鞘脱失和炎性细胞浸润为特点的自身免疫性神经病,表现为肢体对称性弛缓性瘫痪,累及呼吸肌可致死,部分患者遗留严重的神经功能障碍。实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis,EAN）是众所周知的GBS的经典动物模型。辅助性T细胞（helper T cell,Th）其中的Th1/Th17细胞是实验性自身免疫性神经炎（EAN）的炎症和免疫过程的必要参与者。由于Th1/Th17细胞是促炎细胞并且都分泌促炎细胞因子,抑制Th1和Th17分化并减少炎症因子的药物将具有治疗潜力。ZSTK474[2-（2-difluoromethylbenzimidazol-1-yl）-4,6-dimorpholino-1,3,5-triazine],I类PI3K抑制剂,在癌症、自身免疫性脑脊髓炎及类风湿性关节炎等疾病中被广泛研究,具有抗炎和免疫调节的潜能。然而,ZSTK474对吉兰-巴利综合征（GBS）的潜在治疗作用和精确机制尚不明确。迄今为止,多种应用于GBS治疗的可能药物均在EAN动物模型进行验证,但是ZSTK474在GBS中的作用及其机制目前尚未被探索。为了解决这一科学问题,我们团队将ZSTK474应用于EAN模型,在大鼠的临床症状初发时进行药物干预,收集并整理相关数据,包括临床评分、炎细胞浸润及脱髓鞘程度、肌电图检测结果、Th1/Th17表型的分布等;通过分析及评价PI3K抑制剂,ZSTK474,在GBS动物模型上的疗效,探讨相关的信号通络,以期找到它发挥作用的机制。研究方法:我们通过皮下注射周围神经系统抗原P0180-199在Lewis大鼠中诱导EAN。将这些EAN大鼠随机分成对照组和ZSTK474处理的治疗组。记录大鼠每日的临床评分及体重,通过Mann-Whitney U检验评估临床评分以及电生理学和组织病理学变化。在疾病高峰期,通过大鼠坐骨神经的肌电图检测结果来评价坐骨神经损伤程度,主要评价指标为运动神经传导速度（motor nerve conduction velocity,MNCV）,诱发复合肌肉动作电位（compound muscle action potential,CMAP）等,后者潜伏期及波幅,不仅能够有利于诊断,还可以评估转归。之后,留取EAN大鼠的坐骨神经,进行HE和快蓝染色来评价炎细胞浸润和髓鞘脱失程度,并通过免疫荧光技术来探索Th17细胞的变化;同时对坐骨神经进行蛋白提取,并通过蛋白印迹技术验证PI3K通路相关蛋白的改变。留取坐骨神经的同时,留取大鼠脾脏,来获得单个核细胞（Mononuclear cell MNC）,用来分析淋巴细胞增殖情况,通过酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应分析各种炎性因子的水平,进一步通过流式细胞术检测CD4+T细胞的变化。通过GraphPad Prism 5.0软件分析统计相关数据的差异,p<0.05时,代表有统计学意义,p<0.01,两组间差异显著。研究结果:1.ZSTK474处理后,与HPC处理后比较,前者能使EAN大鼠在疾病最严重时的分值下降,能减轻EAN大鼠周围神经损伤的严重程度。同时还减少了临床运动缺损曲线的曲线下面积（p<0.01）。与对照组相比,ZSTK474治疗组具有更少的炎细胞浸润数量（p<0.01）,更轻的髓鞘脱失（p<0.05）。2.坐骨神经肌电图检测结果显示,治疗组MNCV明显增快（p<0.01）,CMAP波幅显著增高（p<0.05）,潜伏期明显缩短（p<0.01）。3.流式细胞术分析脾单个核细胞结果表明,ZSTK474治疗组Th1/Th17数量较对照组有明显减少。说明ZSTK474抑制Th细胞向Th1/Th17极化。P0180-199刺激后,与对照组相比,ZSTK474治疗组的降低了淋巴细胞的增殖,统计学差异具有意义（p<0.01）。4.应用免疫荧光技术来了解Th17在神经组织的浸润情况,结果表明,ZSTK474治疗组相比对照组均显示Th17细胞表型表达下降（p<0.01）,Western印迹分析显示ZSTK474治疗组p-STAT3表达下降（p<0.01）。5.ELISA结果显示:与对照组相比,ZSTK474治疗组促炎症因子（IL-1α,IL-1β,IFN-γand TNF-α）在蛋白水平上在表达量显著下降,其他因子没有显著差异。RT-PCR在翻译水平上也得到了同样的结果,IFN-γ和TNF-α在治疗组下降显著,除此之外,IL-17和IL-23在治疗组也显著减少,表明ZSTK474对促炎因子具有抑制作用。6.Western印迹分析对于EAN大鼠坐骨神经切片中p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K、和p-4E-BP1分析结果显示:与对照组相比,ZSTK474治疗组中p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K和p-4E-BP1表达均减少。研究结论:我们的研究结果表明ZSTK474有效减轻EAN的症状,该机制涉及PI3K/AKT/mTOR通路的抑制,从而影响Th1/Th17细胞的分化,进一步减少促炎细胞因子的产生。对ENA大鼠具有抗炎、免疫调节及神经保护作用。因此,ZSTK474可能作为治疗GBS的一个候选药物。