新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，曾屡次形成世界范围的大流行，给养禽业造成巨大损失。水禽一直被认为是NDV的自然贮存库，鹅、鸭等能携带NDV，但通常不表现任何临诊症状，甚至对NDV强毒株具有坚强的抵抗力。但1997年以来，我国华南和华东地区发生了由NDV导致的鹅的临诊疾病。虽然各地采取了积极的防制措施，该病仍然逐渐蔓延、流行，成为继小鹅瘟之后危害养鹅业的又一主要病毒性疾病。 研究者从历次发病的鹅群分离了大量致病性NDV，发现它们大多为嗜内脏速发型强毒株(VVNDV)，且在基因型分类上属于一个新的基因亚型-Ⅶd亚型，有关这些毒株的生物学特性已经有较多研究。然而，对于健康鹅群中NDV的携带情况以及所携带病毒的生物学特性则鲜有报道。本研究在2003-2005年期间，从江苏、安徽、山东三省的表征健康鹅群分离、鉴定了一定数量的NDV，对其生物学特性及分子流行病学特征进行了研究，并结合本课题组前期的研究成果，对鹅源NDV的来源进行了进一步探讨。 1.表征健康鹅群新城疫病毒的分离和鉴定 自江苏、山东、安徽三省不同地区的表征健康鹅群采集泄殖腔棉拭子样品，分离、鉴定NDV。结果从1108份样品中分离到11株NDV，并测定了11株病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)。其中，6株病毒(SD/1/03/Go、AH/1/04/Go、JS/1/04/Go、SD/2/04/Go、SD/3/04/Go和SD/4/04/Go)的MDT为110.2-192.0h，ICPI为0.101-0.431，被判定为NDV弱毒株；3株病毒(SD/1/04/Go、SD/6/04/Go和JS/1/05/Go)的MDT为84.8-89.4h，ICPI为0.840-0.966，被判定为NDV中等毒力毒株；两株病毒(JS/1/03/Go和SD/5/04/Go)的MDT为53.1-54.6h，ICPI为1.780-1.820，被判定为NDV强毒株。 2.鹅源新城疫病毒融合蛋白基因部分片段的克隆及序列分析 用RT-PCR技术扩增、克隆了上述11株鹅源NDVF基因部分片段，经测序获得F基因5端(cDNA)前1700nt(全长1705nt)序列，分析测定的序列及由其推导的氨基酸序列。结果表明，6株病毒(SD/1/03/Go、AH/1/04/Go、JS/1/04/Go、SD/2/04/Go、SD/3/04/Go和SD/4/04/Go)F蛋白裂解位点序列为¨2G-R-Q-G-R-L117，符合典型的NDV弱毒株特征；5株病毒(SD/1/04/Go、SD/6/04/Go、JS/1/05/Go、JS/1/03/Go和SD/5/04/Go)F蛋白裂解位点序列均为112R-R-Q-K-R-F117，符合典型的NDV强毒株特征。 将11株鹅源NDVF基因编码区1654bp核苷酸序列与新城疫标准毒株及近年来国内外分离的鹅源或鸡源NDV相应序列进行比较。结果表明，6个弱毒株和3个中等毒力毒株之间的同源性大于97％，两株强毒与其他9株病毒的同源性为90.3％-92.1％。根据核苷酸序列推导出相应的551个氨基酸序列，6个弱毒株及3个中等毒力毒株之间的同源性高达97.1％-97.5％，两株强毒与其他9株病毒的同源性为91.8％-93.5％。近年来国内部分鸡源分离株与6个弱毒株和3个中等毒力毒株相应氨基酸序列的同源性超过96％，而11株病毒与1997年以来国内分离到的对鹅具有高度致病性的NDV相应序列的同源性最高仅为94.7％。另外，对F蛋白信号肽区和F蛋白N-未端27个高变氨基酸位点的比较表明，从外表健康鹅分离的11株鹅源NDV，不管是弱毒株、中等毒力毒株还是强毒株，都在相应位点上和某些鸡源毒株有很高的相似性。 以F基因高变区374nt片段(第47～420nt)为基础，用软件绘制遗传发生树，发现6个弱毒株靠得很近，与基因Ⅱ型的LaSota株同处1个分支；3个中等毒力毒株与基因Ⅱ型的TexasGB株共同位于另一个分支；两个强毒株则与近年来分离自发病鹅群的部分Ⅶd亚型毒株共同形成另一个分支。对F蛋白7个特征性氨基酸位点的比较、分析发现，6株弱毒及3个中等毒力毒株与LaSota株、F48E8株分别在7个和6个位点具有完全相同的氨基酸残基；两个强毒株的前4个位点与从发病鹅群分离到的致病性NDV一致，后3个位点则与上述6株弱毒及3株中等毒力毒株完全相同。 结合对F基因第334-1682nt之间3种限制性内切酶HinfⅠ、BstOⅠ和RsaⅠ酶切位点的分析结果和F基因高变区374nt片段的遗传发生树分析结果，将6个弱毒株和3个中等毒力毒株归入基因Ⅱ型，剩余两个强毒株归入基因Ⅶ型。 3.鹅源新城疫病毒血凝素—神经氨酸酶基因部分片段的克隆及序列分析 自上述11株NDV中选取6株(JS/1/04/Go、JS/1/05/Go、SD/1/04/Go、SD/5/04/Go、SD/6/04/Go和JS/1/03/Go)，用RT-PCR技术扩增HN基因部分片段，经克隆、测序获得HN基因编码区从起始密码子ATG至终止密码子TAA共1716nt片段的编码区序列，分析测定的序列及由其推导的氨基酸序列，并与近年来流行的鹅源与鸡源NDV的相应序列进行比较。 结果表明，本研究测定的6株病毒HN基因的编码区长度皆为1716nt，可编码571个氨基酸。6株鹅源NDVHN基因编码区核苷酸同源性为97.1％-99.9％，对应的氨基酸同源性为96.2％-99.7％；与NDV标准强毒株F48E8HN基因核苷酸同源性为83.2％-83.9％，对应的氨基酸同源性为86.5％-87.6％；与NDV标准弱毒株LaSotaHN基因核苷酸同源性为81.6％-99.9％，对应的氨基酸同源性为87.2％-99.7％；与近年来分离的部分致病性鹅源和鸡源NDVHN基因核苷酸同源性为94.8％-99.2％和92.9％-98.8％，对应的氨基酸同源性为95.1％-99.5％和94.2％-98.6％。 HN蛋白氨基酸序列中，6株病毒均在第119-121、341-343、432-434、481-483及508-510位含有1个糖基化位点，但JS/1/05/Go和SD/1/04/Go两株病毒在147-149位多1个糖基化位点N-V-T。6株病毒在第123、172、186、196、238、247、251、344、455、461、465、531及542位含有13个半胱氨酸残基C。与标准毒株LaSota、F48E8及近年报道的鹅源或鸡源NDVHN蛋白氨基酸序列比较发现，6株病毒HN蛋白与细胞受体结合相关区域的氨基酸序列与已报道的NDV相近。验证鹅源NDV在第48、54、77、266、340及384位的6个特征性氨基酸残基发现，6株病毒均含有这6个特征性氨基酸残基，但有3株病毒(JS/1/04/Go、JS/1/05/Go和SD/1/04/Go)在48位的氨基酸残基为M，与LaSota株相应残基相同。 4.结论 1)从表征健康鹅群分离到的NDV大部分为弱毒株，小部分为中等毒力毒株甚至是强毒株； 2)从表征健康鹅群分离到的NDV之间具有很高的同源性，且大部分可以归入基因Ⅱ型，小部分可以归入基因Ⅶ型； 3)与经典的鸡源NDV相比，鹅源NDV在F蛋白和HN蛋白的部分位点发生了氨基酸突变； 4)对鹅具有高度致病性的NDV很可能来源于同期或稍早期在鸡群内流行的NDV强毒株。