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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的流行性疾病。该病的典型临床症状为高热,组织器官出血、阻塞和坏死,周身多发性小出血点,繁殖障碍等。CSFV是一种单股正链RNA病毒,NS5B蛋白是CSFV的非结构蛋白,它具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),在病毒复制的过程中发挥重要作用。研究NS5B蛋白和宿主细胞蛋白之间的相互作用,可以为了解CSFV的感染,认识NS5B蛋白在其感染过程中发挥的作用提供有效工具。在实验室前期的研究中,用含有CSFV NS5B基因构建的诱饵质粒与猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)cDNA文库进行酵母双杂交,成功筛选到了与CSFV NS5B蛋白相互作用的半乳糖凝集素-1(Lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS 1/galectin-1)。galectin-1在细胞内和细胞外都具有很多功能,比如在机体内诱导细胞凋亡,通过调节炎症发生及免疫反应等来抵御外界病原微生物的入侵,还可以影响肿瘤的发生、细胞的黏附、细胞之间信号的转导等。galectin-1可以通过与蛋白或多糖之间相互影响来发挥其功能。本研究通过将CSFV NS5B基因片段克隆含有冷启动子的pCold-SUMO原核表达载体构建了重组质粒,转化Rosetta(DE3)大肠杆菌表达菌,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,成功地将重组蛋白在上清中表达。采用镍柱亲和层析法(NiNTA)进行纯化以获得纯度较高的蛋白,纯化得到的蛋白免疫小鼠以制备抗NS5B的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹(Western blot)验证所制备多克隆抗体的反应性和特异性。发现制备的多克隆抗体可以与原核表达及真核质粒转染瞬时表达的NS5B蛋白发生反应,即通过Western blot可以检测到特异性条带,但与CSFV感染PK-15细胞后裂解所得的天然构象的NS5B蛋白不能发生特异性反应。研究发现CSFV感染的宿主细胞中galectin-1在转录水平(mRNA)和蛋白水平均出现下调。通过分别构建了galectin-1过表达和干扰稳定转染细胞系,接种CSFV后利用实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)对CSFV的转录水平及释放到上清中的病毒滴度水平进行检测。发现干扰PK-15细胞中galectin-1基因的表达可以上调CSFV的转录,过表达galectin-1蛋白下调了CSFV的转录和上清中的病毒滴度,即galectin-1具有抑制CSFV复制的生物学活性,可以为以后研发抗CSFV药物提供新的理论依据。