背景与目的:胃癌是最常见的消化道肿瘤之一,受临床表现和检出手段的影响,导致胃癌确诊常处晚期,使多数患者出现远处转移和化疗耐药性,急需新型诊疗标志物,以解决临床治疗遇到的问题。ETS转录因子家族可以参与调节几乎所有细胞生物过程,在肿瘤细胞中,该家族异常表达与肿瘤的恶性进展密切相关。ELK3是ETS转录因子家族的特殊成员,在Ras和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated protein Kinase,MAPK）的刺激下发生转录促进作用。在肿瘤中,ELK3可作为重要的治疗靶标,其可以促进肿瘤细胞的增殖、转移、耐药和上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）。EMT是胚胎发育及肿瘤转移的细胞形态可塑性改变的关键机制,在肿瘤的侵袭、转移、耐药等过程中发挥了重要作用。研究显示,发生EMT的细胞可以通过多种机制促使肿瘤细胞发生化疗耐药,其中转化生长因子β（Transforming growth factor beta,TGF-β）信号通路作为主要诱导EMT的因素可使癌细胞对化疗药物发生更强的耐药性。报道表明,ELK3不仅可以促使TGF-β信号转导,还可以促使肿瘤细胞发生EMT和耐药等表型。而ELK3在胃癌中是否可诱导上述过程发生、具体机制和相互关系尚不清晰。为解决这些问题,本研究首先基于生物信息学,探索ELK3在胃癌中的表达预后及其影响肿瘤细胞增殖、转移和耐药的潜在机制;其次进行体内体外实验,验证ELK3能否通过活化TGF-β信号促进EMT诱导胃癌化疗耐药,并分析其具体机制。从而阐明ELK3影响胃癌进展的调控模式,将有助于胃癌的精准治疗,为我国开发更多具有自主知识产权的抗癌药物提供理论基础。材料与方法:1.ETS转录因子家族综合分析（1）整合肿瘤基因组图谱和基因型组织表达数据库关于胃和胃癌的测序数据,分析ETS转录因子家族在胃癌和正常胃组织间的差异表达;结合数据库中的临床数据,分析ETS转录因子家族在不同临床病理特征中的表达水平差异;（2）利用肿瘤基因组图谱数据库中胃癌的拷贝数和单核苷酸多态性数据,分析遗传状态改变影响ETS转录因子表达的可能;（3）基于ETS转录因子家族在胃癌的表达数据和肿瘤基因组图谱数据库中胃癌的DNA甲基化数据,分析ETS转录因子家族DNA甲基化水平差异,并分析其m RNA表达与DNA甲基化水平相关性;（4）利用数据库中胃癌预后信息,单因素和多因素Cox回归分析ETS转录因子家族与预后的关系,结合病理特征分析ELK3独立预后性能。2.ELK3表达预后验证及对胃癌细胞增殖、转移的影响（1）获取GEO和Array Express数据库中胃癌表达谱微阵列数据集,提取配对样本,利用配对样本t检验验证胃癌和癌旁组织的ELK3表达差异;（2）收集临床胃癌样本,通过免疫组织化学染色、Western-blot、实时荧光定量PCR分析ELK3在临床胃癌样本和癌旁组织中蛋白和m RNA水平表达差异,并分析ELK3的m RNA表达与临床病理特征的相关性;（3）在Kaplan-Meier Plotter网站分析胃癌Affymetrix平台微阵列数据集中ELK3与预后的关系;利用多数据集meta分析从GEO和Array Express数据库获取到的胃癌表达谱微阵列数据集,进一步验证ELK3是否与不良预后相关;（4）从GEO数据库获取胃癌细胞系数据集,整合并分析ELK3在不同胃癌细胞系的表达,并利用Western-blot、实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光验证ELK3在胃癌细胞系和正常胃黏膜细胞系的表达;（5）在胃癌细胞系中改变ELK3的表达,通过细胞周期检测、细胞平板克隆形成、EDU染色、细胞划痕、Transwell、Western-blot分析ELK3对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。3.ELK3促进TGF-β信号影响胃癌进展的机制初步分析（1）通过对胃癌样本量大于200的数据集进行基因集富集分析,并进行Venn分析处理,鉴定在不同数据集中高表达ELK3的样本共富集的信号通路;（2）在胃癌细胞中改变ELK3表达的同时联用TGF-β活性因子处理,利用细胞划痕、Transwell、Western-blot分析ELK3对胃癌细胞TGF-β信号通路和EMT表型的影响。4.ELK3调控TGFBR2促使胃癌EMT的机制探讨（1）通过对胃癌和正常胃组织均大于200的数据集进行基因集富集分析,了解胃癌样本中的Ras和MAPK信号是否活化,分析ELK3在胃癌中是否具有转录激活作用;（2）通过生物信息学分析TGF-β受体2（TGF-βReceptor 2,TGFBR2）是否是ELK3下游靶基因,并在多数据集中分析ELK3和TGFBR2在m RNA表达水平的相关性;（3）在临床样本中分析TGFBR2的m RNA表达,分析在临床样本中ELK3和TGFBR2表达相关性;并在胃癌细胞中改变ELK3表达,Western-blot和实时荧光定量PCR分析TGFBR2表达变化;（4）公共数据库预测TGFBR2启动子区域ELK3的结合位点,并利用染色质免疫共沉淀和双萤光素酶报告基因实验验证ELK3是否直接调控TGFBR2;（5）在胃癌细胞中改变ELK3表达的同时联合改变TGFBR2的表达,利用细胞划痕、Transwell、Western-blot分析TGF-β信号转导和EMT表型的改变。5.体内体外研究ELK3诱导化疗耐药机制（1）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）处理ELK3表达改变的胃癌细胞,利用Tunel染色检测细胞凋亡数;（2）不同浓度5-FU处理ELK3表达改变的胃癌细胞,利用CCK-8检测细胞增殖,分析5-FU在不同细胞的半数抑制浓度;（3）5-FU和EMT抑制剂Rondomycin联合处理ELK3表达改变的胃癌细胞,通过流式细胞术检测细胞凋亡率、Western-blot分析EMT表型、耐药、凋亡的变化;（4）对稳定改变ELK3胃癌细胞构建小鼠尾静脉转移模型,分析转移和EMT的表型的变化;同时构建裸鼠成瘤模型,并加用5-FU处理,分析不同处理组的成瘤能力改变。结果:1.胃癌中ETS转录因子家族综合分析显示ELK3是核心基因（1）对29个ETS转录因子进行差异分析显示,胃癌中有22个表达上调,6个表达下调,23个的基因表达与临床病理特征相关;（2）有12个ETS转录因子的DNA甲基化水平失调,其中有11个基因的m RNA表达与DNA甲基化水平呈负相关,提示可能存在DNA甲基化调控表达的可能;所有基因的表达水平与遗传状态改变相关性低;（3）有4个ETS转录因子的表达与总体生存期相关,4个与无进展生存期相关,其中ELK3能同时预示两种预后结局,是胃癌患者独立预后因素。2.ELK3作为癌基因促进胃癌细胞恶性进展（1）对15个胃癌数据集进行生物信息学分析,免疫组织化学染色分析15对冰冻临床胃癌样本,Western-blot、实时荧光定量PCR分析81对新鲜胃癌样本的结果均表明,ELK3在胃癌组织中的表达均显著高于正常癌旁组织;临床队列的研究显示ELK3的表达与组织分化程度、T分期、N分期和病理分期相关;（2）对Affymetrix平台的数据集数据进行Kaplan-Meier分析表明,ELK3与不良预后相关;对多数据集进行预后meta分析显示,高表达ELK3的胃癌患者预后不良;（3）在高表达ELK3的Hs746t胃癌细胞中下调ELK3表达,抑制了细胞增殖、侵袭、迁移;在低表达ELK3的HGC27胃癌细胞中上调ELK3,细胞增殖、侵袭、迁移能力升高。3.ELK3通过经典TGF-β信号促进胃癌EMT（1）对6个数据集进行基因集富集分析,获得的结果进行Venn分析,共得到Epithelial mesenchymal transition（EMT）、TGF-β等共16个共富集信号通路;（2）在Hs746t细胞中敲低ELK3,可以抑制细胞侵袭、迁移、TGF-β信号转导和EMT表型;在HGC27细胞中过表达ELK3,可促进这些信号和细胞表型;TGF-β因子处理后进一步促进这些细胞功能表型和信号转导。4.ELK3转录调控TGFBR2活化TGF-β信号表达促进胃癌EMT（1）通过生物信息学分析,在6个数据集共富集到的TGF-β信号通路中鉴定得到TGFBR2等11个共富集核心基因,在多个数据集中均显示ELK3与TGFBR2表达正相关;（2）在新鲜胃癌样本中,ELK3表达与TGFBR2显著正相关,在胃癌细胞中改变ELK3的表达均导致TGFBR2发生相应的表达改变;（3）经基因集富集分析,胃癌样本中的Ras和MAPK信号通路均显著富集,提示ELK3可作为转录激活因子;公共数据库预测到TGFBR2启动子区有3个ELK3结合位点,染色质免疫共沉淀和双萤光素酶报告基因实验表明其中两个位点具有转录活性;（4）在稳定敲低ELK3的Hs746t细胞中上调TGFBR2,逆转了细胞侵袭、迁移、TGF-β信号转导和EMT表型的抑制;在稳定过表达ELK3的HGC27细胞中下调TGFBR2抑制细胞上述功能、信号转导和表型。5.ELK3通过促进EMT诱导胃癌化疗耐药（1）抑制ELK3表达可以降低5-FU对胃癌细胞的半数抑制浓度,过表达可升高5-FU对胃癌细胞半数抑制浓度,促进化疗耐受;（2）在Hs746t细胞中,抑制ELK3表达联合5-FU组比单用5-FU组细胞凋亡水平上升,促EMT和耐药相关蛋白表达下降;在HGC27细胞中,促进ELK3表达联合5-FU组细胞凋亡率较单用5-FU组低,促EMT和耐药相关蛋白表达上调;加用Rondomycin处理后,各组凋亡水平均相应升高,促EMT和耐药蛋白表达下降;（3）裸鼠尾静脉模型结果显示,下调ELK3抑制胃癌细胞体内转移能力和EMT表型,过表达ELK3促进了细胞转移和EMT;（4）裸鼠皮下成瘤模型结果显示,下调ELK3抑制了胃癌细胞成瘤能力,过表达ELK3成瘤能力上升;下调ELK3同时联用5-FU成瘤能力低于单用5-FU组,过表达ELK3联用5-FU组成瘤能力高于单用5-FU组。结论:1.ETS转录因子ELK3在胃癌组织中高表达,与胃癌不良预后相关;2.ELK3促进胃癌细胞增殖迁移,在胃癌中充当癌基因;3.ELK3通过调控TGF-β信号促进胃癌细胞EMT;4.ELK3转录激活TGFBR2表达促进TGF-β信号诱使胃癌EMT;5.ELK3通过EMT促进胃癌细胞化疗耐药。