研究背景帕金森病(Parkinson disease, PD)是一种常见于中老年人的第二大神经退行性疾病。随着老龄化社会的来临,PD患病率正在世界范围内逐年增高,据世界帕金森病协会近年资料显示,全球本病患者已超过400万,我国居全球之首。因此帕金森病已经成为我国乃至世界各国面临的重大医学和社会问题。本病确切病因未明,现代医学缺乏理想效果的治疗药物,中医药厚朴提取物单体在治疗PD的临床研究中积累了许多经验,但迄今未见中药厚朴提取物在分子水平上阐明其对PD模型内质网应激与泛素-蛋白酶体系统影响的机制。因此,为发挥中医药特色和优势,积极探索本病的中医药治疗方法,对研究开发治疗帕金森病的中药新药有现实的意义研究表明：中脑黑质多巴胺(DA)能神经元变性缺失伴胞浆内Lewy小体的形成是帕金森病的主要病理改变。而Lewy小体内主要聚集了许多蛋白包括脂质、神经丝和相关的a-共核蛋白(a-synuclein).泛素和泛素途径相关酶。现在普遍认为神经细胞的死亡是a-synuclein等蛋白构象改变,形成淀粉样丝状物异常聚集所致。但目前研究大多在毒性蛋白质的生物合成途径,却少有研究其降解和代谢途径。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)是细胞内重要的溶酶体外降解系统,它可以发现和破坏这些装配和折叠错误的蛋白,使它们及时降解。因此,UPS的功能异常是PD发病中一个十分重要的环节。异常蛋白的不断聚集与UPS的功能缺损密切相关。最新研究发现：内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)也是该过程中一个至关重要的环节。当严重的或长时间的内质网应激损伤了内质网的功能时,即可引发细胞凋亡。由内质网应激诱发的凋亡途径有三条：1.CH0P/GADD153基因的激活转录；2.JNK的激活通路；3.内质网特有的半胱氨酸蛋白酶caspase-12的激活。此外,研究还表明内质网应激反应的标志性蛋白是GRP78/Bip.在疾病的早期,GRP78/Bip表达上调是对细胞的保护性反应,也是ERS的应激标志。而长期的应激则启动凋亡通路,损伤细胞。当今,ERS和UPS已成为国外研究的热点,但还未研制出能够有效干预ERS及改善UPS功能的药物,国内中药对ERS和UPS干预影响的研究尚属空白。现代医学对本病的治疗药物主要有多巴胺类和多巴胺受体激动剂,早期效果显著,但有副作用大,价格昂贵,长期应用逐渐耐药等缺点。因此,积极探索中医药治疗显的更有重要意义。本病属于中医颤证范畴,导师吴正治教授对本病病机有新的学术观点。认为：本病的病位主要在肌肉,其四大主症震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常都和肌肉密切相关,根据中医学脾主肌肉的理论,本病应从脾论治。吴教授认为本病病机,其本在脾。脾虚水湿不化,湿性黏滞,易阻气机,湿困肌肉、气机不畅故身体重着、运动迟缓；脾虚则气血生化无源、筋失所养、血虚生风故肢体震颤、肌肉强直、姿势步态异常。著名中医脑病专家任继学亦认为本病“以脾为根,以肝为标”。因此,认为本病的病机关键为“脾湿困阻、气机不畅、肌肉失主”,其治疗当以醒脾理气化湿为要,辅以活血柔肝止痉。厚朴提取液是导师吴正治教授在所承担的国家十五科技攻关项目“帕金森病中西医结合综合治疗优化方案研究”的工作期间,以古今文献相关方药经过系统整理,结合多年科研和临床经验及其所提出的本病新的中医观点,经筛选优化而出的天然中药。其经过多年临床应用,对早中期帕金森病疗效显著,对晚期帕金森病患者也有一定疗效。这为本课题研究打下了良好的基础。研究目的本课题结合帕金森病研究的新进展新动态,采用连续注射MPTP诱导模拟人的帕金森病慢性病程和具有病理Lewy小体形成的动物模型,探讨ERS、 UPS在帕金森病发生发展中的作用；同时观察天然中药厚朴提取物对帕金森病模型中ERS、UPS及Lewy小体形成的影响,揭示其治疗PD病的干预靶点与分子机理,为进一步开发治疗PD中药新药提供实验依据,并为本病临床治疗开辟新思路。研究方法(1)建立PD模型及实验分组选取健康雄性C57BL/5J小鼠48只(9周龄),随机分成3组,分别为PD模型组16只,正常对照组16只,厚朴提取液组16只。(2)动物行为学观察注射后7d、14d和21d按0.25mg/kg腹腔注射阿扑吗啡,观察旋转行为的变化,共记录30min取平均值。同时注意观察震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为。(3)黑质区TH、GFAP、OX-42免疫组化检测注射后第21天,在2.5%戊巴比妥钠麻醉下,从左心室插管灌注4%多聚甲醛,之后断头取脑,经系列生化固定后,自近黑质部位起连续冠状切片,而后挑取对称的黑质区切片,行TH、GFAP、OX-42免疫组织化学染色。观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞,星形胶质细胞(GFAP)及小胶质细胞(OX-42)的变化,以了解DA能神经元损毁情况是否选择性地损毁多巴胺能神经元和GFAP及OT-42是否激活。切片再经系列生化免疫标记,置显微镜观察,计数两侧黑质TH阳性细胞数。(4)α-synuclein、Parkin和泛素(ubiquitin)的免疫组化检测通过免疫组织化学染色法观察DA能神经元内蛋白聚集的Lewy小体及其主要成分a一共核蛋白(a-synuelein)、Parkin和泛素(Ubiquitin)的表达。切片经系列生化免疫标记后,显微镜观察,显微图象分析系统定量检测。模型组、正常组、厚朴提取液组处理时间和剂量完全相同。(5)RT-PCR检测黑质区组织Caspase-12mRNA的表达GenBank检索小鼠Caspase-12序列,自行设计引物,由上海Sangon公司合成。Caspase-12引物(506bp)上游:5’-AGGC AACTCTCATGCAGTTC-3’(1319-1338bp),下游：5’-AACCATGTATGCCAGAG AC C-3’(1847-1866bp)。取总RNA4ul,经系列生化处理,取PCR扩增产物10μl行琼脂糖凝胶电泳,经凝胶成像系统扫描Caspase-12灰度值。比较各组黑质区组织Caspase-12mRNA的表达。(6)Western blot检测黑质区组织Caspase-12,CHOP、Bip/GRP78蛋白的表达80μ g黑质组织蛋白经SDS-PAGE电泳,不同蛋白分别进行免疫印迹反应,ECL化学发光试剂作用后X胶片曝光,经显影、定影等处理后观察结果。用Touching2002凝胶成像系统扫描图像,对其灰度分析。比较各组黑质区组织Caspase-12,Bip/GRP78蛋白的表达。(7)显微图象定量分析采用本实验室智能化自动显微图象定量分析系统进行定量分析。(8)数据统计数据统计采用均值(x)±标准差(s),采用SAS软件包行单因素方差分析检验,以P<0.05表示有显著性差异。研究结果1.动物行为学采用腹腔连续注射MPTP已成功制成慢性病程PD小鼠模型,小鼠行为学实验结果提示：厚朴提取液能提高肢体运动协调能力,对MPTP诱导所致的PD模型小鼠的PD运动体征具有明显的改善作用。2.黑质区TH.GFAP、0X-42免疫组化检测结果显示：与对照组相比,PD模型组小鼠黑质区TH表达显著降低(P<0.01),表明TH阳性神经元显著丢失,提示DP能神经元凋亡明显.GFAP变化不明显(p>0.05),OX-42表现增多,表明MTPT选择性地损毁DP能神经元；经厚朴提取液灌胃处理的中药组小鼠TH阳性细胞数无明显减少,提示中药厚朴提取液组的DP能神经元受到中药保护,未明显损伤。3.α-synuclein.Parkin和泛素(ubiquitin)的免疫组化检结果显示：与模型组相比,中药厚朴提取液组黑质细胞凋亡明显减少(P<0.01),中药厚朴提取液组a-synuclein、Parkin、ubiquitin阳性细胞数均减少(P<0.01),表明细胞内质网生成的毒性蛋白质a-synuclein减少,毒性蛋白质的泛素降解通路正常或提高。表明ERS功能受到保护性干预和UPS的功能活性良好。提示厚朴提取液可抑制PD小鼠模型黑质细胞的凋亡,可保护和改善ERS及UPS的功能。4.RT-PCR检测黑质区组织Caspase-12mRNA的表达RT-PCR结果：PD模型组小鼠黑质区组织Caspase-12mRMA表达水平较对照组显著增高；厚朴提取液组小鼠黑质区组织Caspase-12mRMA表达水平较模型组显著下调。Caspase-12mRMA表达水平表示内质网应激反应水平高低。提示腹腔注射MPTP可诱导小鼠脑黑质区神经元的内质网应激反应,厚朴提取液对内质网应激反应有一定的缓解作用。5.Western blot检测黑质区组织Caspase-12,CHOP、Bip/GRP78蛋白的表达结果显示,Western blot检测模型组小鼠黑质区Caspase-12、CHOP蛋白表达水平较正常对照组显著上调(P<0.01),提示黑质区神经元的内质网应激反应提高。厚朴提取液组Caspase-12、CHOP蛋白表达水平较模型组明显降低(P<0.05)。GRP78/Bip作为一种分子伴侣在蛋白质的折叠和转运过程及内质网应激反应中发挥重要作用,它在多种肿瘤组织中呈高表达。内质网应激早期可通过GRP的表达增多来保护细胞。模型组小鼠黑质区组织GRP78/Bip蛋白的表达较正常对照组上调,厚朴提取液组GRP78/Bip蛋白的表达较模型组进一步上调(P<0.05)。上述结果提示：腹腔注射MPTP可诱导黑质区神经元的内质网应激反应,而厚朴提取液可有效改善PD模型小鼠黑质区神经元的内质网应激。研究结论小鼠行为学表明：一.采用MPTP注射法,造模成功。厚朴提取液能提高肢体运动协调能力,对MPTP诱导所致的PD模型小鼠PD运动体征具有明显的改善作用。二.内质网应激和泛素-蛋白酶体系统可能是PD多巴胺能神经元凋亡的关键因素,内质网应激的早期调节过程就存有泛素-蛋白酶体系统对异常蛋白的降解活动。ERS和UPS有相互促进作用,以达到内质网蛋白合成与降解的动态平衡,保证内环境的稳定。中药厚朴就是通过黑质区组织Caspase-12mRNA的表达和Caspase-12,CHOP、Bip/GRP78蛋白的表达靶点的干预来实现对内质网应激反应(ESR)的影响和改善,减少细胞毒性蛋白的合成。通过α-synuelein.Parkin和泛素(ubiquitin)蛋白的表达靶点的干预来实现对泛素蛋白酶体系统(UPS)的影响和改善,提高发现和破坏这些装配和折叠错误的蛋白的能力,使它们及时降解,从而消除细胞毒性蛋白,改善和保护黑质区多巴胺(DA)能神经元神经细胞,减少细胞凋亡。因而,中药厚朴对多巴胺能神经元的有明显的保护作用。关键词帕金森病；厚朴提取液；泛素-蛋白酶体系统；中脑黑质多巴胺(DA)能神经元；Lewy小体；α-共核蛋白；去泛素化酶；酪氨酸羟化酶；内质网应激；细胞凋亡。