本论文由两部分组成:第一部分是亚型选择性丙酮酸脱氢酶激酶不可逆抑制剂的研究。癌细胞的代谢异常是新近发现的肿瘤组织有别于正常组织的特征之一。其中,以肿瘤细胞对葡萄糖的代谢异常最为突出,主要表现为有氧糖酵解通路的增强和氧化磷酸化途径的减弱,即肿瘤细胞即使在氧充足的条件下,也主要通过糖酵解的方式分解葡萄糖,而非通过三羧酸循环的氧化磷酸化途径生产ATP,这种以有氧糖酵解为主的代谢方式被称之为"Warburg"效应。这种看似低效的代谢方式能从能量和物质等多个方面满足肿瘤细胞增殖的特殊需求。此外,"Warburg"效应还贡献于肿瘤细胞的凋亡抵抗、恶性微环境的维持、转移与耐药等方面,是肿瘤细胞存活与增殖的基础。酮酸脱氢酶激酶(PDK)能通过磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)而改变细胞的葡萄糖代谢路径,是细胞糖代谢调节网络的关键节点。PDK有四种亚型(PDK1-4),它们在人体内具有特异性的组织分布,其中PDK1在大多数肿瘤细胞中都异常高表达,并且与癌症患者的预后和生存、放化疗响应、耐药的产生等密切相关。因此,PDK1已成为靶向肿瘤糖代谢的抗癌策略中极具潜质的靶点。在本论文前,主要有三种PDK抑制剂类型见诸报道,以不同的结合位点加以区分。第一类抑制剂作用于丙酮酸结合位点,代表性化合物是二氯乙酸(DCA),DCA可以看做是PDC底物丙酮酸的小分子类似物,但其较弱的抗癌活性及往往需要过大给药剂量(100 mg/kg)等因素影响了DCA的临床应用。第二类抑制剂作用于二硫辛酸口袋,代表性化合物主要有Nov3r、AZD7545和CPI6I3。除了CPI613外,其它的该类抑制剂抗癌效果较弱,而CPI613作为辅酶因子二硫辛酸的模拟物,其副作用涵待考察。第三类抑制剂属于ATP竞争型抑制剂,代表性化合物有Radicicol、M77976等,考虑到人体内含有大量与ATP结合的酶,此类抑制剂的选择性往往较差,由此产生的副作用很难避免。在先前的工作中,本课题组通过对课题组内老药库的PDK1抑制活性筛选及简单的化学改造发现了第一个PDK1不可逆抑制剂JX06。以JX06为探针,进一步发现了抑制剂作用于PDK1一个全新的结合口袋,并阐明了其共价修饰的酶活调控机制,提出了新的靶向PDK1策略。本论文进一步基于JX06的结构骨架,设计并合成了两系列共42个含有二硫键的JX06衍生物(1a-m、2a-s、3a-j)。首先测试了这些衍生物对PDK1的半数抑制浓度(IC50),得到了初步的构效关系(SAR),发现了22个有显著PDK1抑制活性的衍生物(1c-d、1f—m、2a-d、2f、2i、2j-k、2m-n、2p和3a,IC50<0.3μM)。考虑到这些衍生物属于共价抑制剂,我们引入了kinact/Ki(second-order rate constant of target inactivation)作为不可逆抑制剂抑制强度的定量指征对所得SAR进行了验证,结果表明IC50与kinact/Ki表现出良好的相关性。进一步采用免疫印迹法在细胞水平测试了优选的22个衍生物对PDK1的抑制活性,发现衍生物2k和3a在细胞水平展现出最优的PDK1抑制活性,且具有良好的浓度依赖性,它们在所有测试浓度中对S232和S293两个磷酸化位点都显示出了良好的抑制效果。后续的一系列药理实验证实2k和3a是通过类似于JX06的共价机制对PDK1产生抑制,并藉此改变肿瘤细胞的葡萄糖代谢路径。通过测试优选衍生物2k、3a及先导化合物JX06对PDK四种亚型的kinact/Ki值,发现化合物3a表现出最强效的PDK1抑制活性(IC50= 26 nM;kinact/Ki=5.14×103M-1s-1),而且相比于PDK2-4抑制活性,3a对PDK1显示出了超过40倍的亚型选择性,该亚型选择性明显优于JX06和2k。为了解释3a对PDK1发挥选择性抑制的分子机制,应用分子对接模拟出2k、3a和JX06与PDK1-4的相互作用模式,从共价反应距离和空间适配性等方面较好的阐释了3a选择性抑制PDK1的原因。接下来我们考察了JX06、2k和3a在体内外的抗肿瘤药效。在体外抑制细胞增殖实验中,化合物3a对肿瘤细胞增殖的抑制效果最优,且对其它两种人正常细胞没有明显的抑制作用。在动物体内实验中,3a表现出了与JX06类似的肿瘤抑制效果(TGI = 47.8%@ 80 mg/kg)。值得关注的是,3a对实验动物体重没有任何负面影响,明显优于JX06,我们认为这可能得益于其良好的PDK1亚型选择性。本部分工作发现的化合物3a,作为第一代亚型选择性PDK1不可逆抑制剂,有良好的潜力成为靶向肿瘤代谢通路研究中的工具分子或先导化合物。第二部分是抗耐药金黄色葡萄球菌候选药物开发。本实验室前期研究发现抗真菌老药盐酸萘替芬及其衍生物,作为金黄色葡萄球菌关键致病因子金黄色素合成通路催化酶CrtN的抑制剂,在感染前给药(预防给药)的模式中表现出了良好的体内抗菌药效。本论文以课题组前期发现的呋喃类CrtN抑制剂C13为先导结构,在保持C13良好的体内外药效的前提下,通过结构优化来降低C13较强的hERG抑制毒性,并且探索在动物药效评价中增加感染后给药(治疗给药)的实验组,试图开发出具有良好成药性和应用价值的抗耐药金黄色葡萄球菌候选药物。我们以C13为先导化合物,通过生物电子等排将C13结构中的苯并呋喃环替换成吲哚环,并依据色素抑制活性(Newman菌株)对结构中的四个不同区域(A-D)分别进行了结构优化,总结归纳出相应的构效关系。最终发现一个含有端位联苯基团的衍生物44具有最强的Newman菌株色素抑制活性(IC50= 3.3 nM),化合物44在三株耐药金黄色葡萄球菌株USA300、USA400及Mu50的色素抑制活性测试中也表现出了纳摩尔级别的色素抑制活性。在高达0.2 mM的药物浓度下,44对上述四株细菌的生长没有明显的不良影响,证实了化合物44并不抑制细菌的生长,而是仅仅消减细菌的致病力。通过高效液相色谱分析给药前后细菌金黄色素代谢通路的代谢物变化情况,证实CrtN是化合物44的作用靶标,在细菌细胞裂解液中发现44对CrtN具有强效的酶抑制活性。在过氧化氢(模拟活性氧)及人血的免疫杀伤模型中,化合物44能够显著提高细菌对免疫杀伤的响应,表现出了良好的体外抑菌效果,从功能上验证了化合物44是通过消减细菌致病力发挥抗菌药效。在小鼠系统感染Newman菌株实验中,化合物44在感染前给药和感染后给药两种模式中都表现出了良好的抗菌药效,可显著地降低Newman菌在小鼠肾脏、心脏和肝脏中的定植(抑菌率普遍高于95%)。针对致死剂量Newman菌供毒的败血症模型中,化合物44也能有效延长小鼠的存活时间。此外,体外抗真菌活性测试结果显示,化合物44完全丧失了抗真菌活性,表现出选择性的抗细菌活性。最后我们测试了化合物44对hERG钾通道的抑制活性,结果表明44几乎没有hERG抑制毒性(IC50>40 μM),远优于先导化合物C13(IC50= 3.7 μM)。目前本课题组正在开展化合物44对耐药金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性评价。已有的结果表明本论文针对C13的结构优化是成功的,最优化合物44不但保持了先导化合物C13强效的体内外抗菌活性,而且极大地改善了对hERG抑制带来的潜在心脏毒性。在新设计的小鼠体内抗菌实验中,化合物44在感染后给药(治疗给药)的模式中依然能表现出良好的抗菌药效,这也为后续的临床前开发提供了更有说服力的药效数据。本部分工作发现的化合物化合物44,具有更优的药物安全性、更合理的体内抗菌效果,可以作为靶向细菌致病力的抗耐药菌候选药物进一步深入开发。