葛根素注射液在我国临床治疗心血管疾病过程中有着卓越的疗效,但能导致严重的血管内溶血。目前,已有多篇文章报道葛根素注射液致溶血相关机制,并对葛根素溶血进行了分类,但至今没有统一的认识和理解。本研究借助普通光学显微镜、普通暗场显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、活细胞工作站及荧光倒置显微镜观察葛根素处理后红细胞形态的变化,通过测定红细胞胞内外渗透压,选择多种化合物进行拮抗实验,以SDS-PAGE电泳、非还原电泳、蛋白质免疫共沉淀以及质谱分析鉴定出的蛋白和肽段为依据,探索葛根素致溶血相关机制。目的在于重新认识葛根素致溶血的靶点、参与者和机制,并确认能够拮抗葛根素溶血的化合物,为葛根素应用提供理论依据。本研究取得的主要结果如下:1.体外葛根素致溶血模型的建立。按照中国药典的方法建立体外溶血体系并计算溶血率。以二甲基亚砜（DMSO）作溶剂,分别用终浓度为2、4和8 mmol/L的葛根素处理小尾寒羊红细胞。结果显示与葛根素浓度对应剂量的DMSO导致的溶血率远低于葛根素导致的溶血率。表明葛根素体外致溶血反应与溶剂无关。2 mmol/L葛根素不会导致小尾寒羊红细胞溶血,4 mmol/L葛根素引起轻微溶血,8 mmol/L葛根素造成约10%的溶血,因此本研究后续试验以小尾寒羊红细胞为模型,选择的葛根素终浓度为8 mmol/L。2.确定葛根素溶血是否与葛根素的浓度、溶血体系的体积、不同种类的红细胞以及渗透压等因素相关。用终浓度为2,4,8,20,25和50 mmol/L的葛根素分别处理红细胞,结果显示葛根素浓度从4 mmol/L起,其溶血率已与对照组有显著差异。溶血率随葛根素浓度增大而增大。但在浓度超过25 mmol/L以上时,溶血率恒定。各组溶血率随葛根素浓度的升高而呈现“S”型曲线。提示葛根素溶血可能与渗透压有关。在葛根素终浓度为8 mmol/L的前提下,孵育体积设为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 m L。结果显示随着体积增大,各组溶血率先升高后降低。表明溶血与体积变化有关,提示溶血与渗透压有关。利用葛根素分别处理小鼠、小尾寒羊、新西兰家兔、鸡和蟾蜍5种动物的红细胞,以上五种动物的红细胞都发生溶血（鸡和蟾蜍的数据未显示）,表明葛根素引起的溶血没有物种特异性,具有同一的致溶血机制。测定细胞内外的渗透压,结果显示1 mmol/L葛根素处理的红细胞胞外和胞内渗透压分别是正常渗透压的1.72和3.10倍,8 mmol/L葛根素使胞外和胞内渗透压分别升高1.57倍和2.59倍。表明葛根素导致渗透压显著升高。测定胞内外钙、磷、钠、钾和氯离子浓度,结果显示胞内外离子浓度变化不大。表明葛根素造成的胞内渗透压升高与胞内离子浓度无关。测定细胞内外蛋白质含量,结果显示2 mmol/L葛根素处理组的胞内总蛋白含量比对照组显著升高了0.05倍,4 mmol/L葛根素组的胞内总蛋白含量显著升高了0.04倍,8mmol/L葛根素组的胞内总蛋白含量显著降至对照组的0.93倍。表明葛根素造成的胞内渗透压升高主要源自蛋白质含量显著增加。提示葛根素能够引起胞内胶体渗透压升高。这可能与细胞膜蛋白和胞浆蛋白的释放或降解有关。用高渗葡萄糖溶液、果糖溶液和氯化钠溶液预处理红细胞,再用葛根素诱导溶血。结果显示5倍渗透压的高渗溶液能够拮抗葛根素溶血。亦提示葛根素溶血与胞内渗透压升高有关。用高渗葡萄糖溶液对预处理,然后用生理盐水洗涤高渗葡萄糖溶液预处理的红细胞沉淀。葛根素组处理相同。结果显示溶血加剧,溶血率能够达到42.63%。以上结果提示葛根素导致胞内胶体渗透压剧烈升高导致溶血,其机理与高渗溶血机理类似。3.借助普通光学显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察2、4和8 mmol/L葛根素处理的小尾寒羊红细胞;利用普通暗场光学显微镜观察1 mmol/L葛根素处理的小尾寒羊红细胞,活细胞工作站和荧光倒置显微镜观察1 mmol/L葛根素处理的小鼠红细胞。观察到红细胞的形态变化主要包括边缘卷起,细胞收缩,体积变小,细胞膜及胞内蛋白成分分布不均,后外泄;胞膜出现缺口。主要的细胞形态为棘形、球形、正在发生溶血的红细胞以及鬼影细胞。在低浓度葛根素处理时,红细胞形成棘形、球形,体积变小,细胞收缩,提示肌动蛋白聚合;细胞膜及胞内蛋白成分分布不均,及出现的鬼影细胞,提示细胞骨架解聚,并与血红蛋白一起释放到胞外。通过以上的试验进一步提示,细胞膜及胞内蛋白成分释放到胞内和/或胞外,细胞内渗透压剧烈增高,肌动蛋白收缩,细胞骨架解聚,因此,推测细胞膜及胞内大部分蛋白都参与了上述过程,包括血红蛋白、酶、转运蛋白和骨架蛋白。通过活体细胞的动态观测和静态形态学观察,结果相互印证,葛根素确实导致了细胞膜及胞内蛋白成分的解聚和释放,最终参与了溶血。4.确定各种转运通道是否与葛根素溶血相关。100m M Ca2+及其螯合剂都能抵消葛根素的溶血,表明溶血与Ca2+酶调节的作用无关;带3蛋白的转运底物(分别是10m M Cl-、K+、Na+、HCO3-、SO42-)和抑制剂DIDS（4,4’-二异硫氰酸基-2,2’-二苯乙烯磺酸二钠）均可拮抗葛根素的溶血;Na+-K+-2Cl-共转运通道抑制剂呋塞米,K+-Cl-共转运通道抑制剂NPPB（5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸）,多药耐药蛋白转运通道抑制剂维拉帕米,氨基酸转运通道底物谷氨酸钠和精氨酸,都能拮抗葛根素的溶血。结果表明,试验中的所有通道都参与了葛根素的溶血,可能与其本身的转运功能无关,应与通道的结合有关,推测底物或抑制剂与通道的结合影响了葛根素处理的红细胞的蛋白相互作用。5.已经证实葛根素的溶血与骨架蛋白密切相关。实验中利用肌动蛋白聚合态的抑制剂细胞松弛素B;丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸以及酪氨酸蛋白酶的抑制剂抑肽酶、二硫苏糖醇、亮抑酶肽和苯甲基磺酰氟分别作为干预剂对红细胞进行预处理。结果显示,以上干预剂均能够显著拮抗葛根素溶血。进一步提示,只要与葛根素导致的红细胞蛋白相互作用有交集（直接或间接）,即可拮抗葛根素溶血,而没有特异性。6.确定葛根素在红细胞上是否存在靶点。利用转运蛋白（Translocator Protein,TSPO）的配体,包括抑制剂PK11195、激动剂Ro5-4864和底物地西泮对红细胞进行预处理。结果显示,以上配体均能显著拮抗葛根素溶血。TSPO与VDAC（Voltage-dependent anion channel,VDAC）、ANT和亲环蛋白D（Cyclophilin D,Cyp D）共同组成“TSPO复合物”。利用VDAC的抑制剂鱼藤酮、ANT的抑制剂羧酸苍术苷以及Cyp D的抑制剂环孢素A预处理红细胞,同样可以显著拮抗葛根素溶血。提示红细胞膜上“TSPO复合物”亦参与了葛根素溶血过程,其机制与配体的功能无关,与配体亲和性有关。只要配体与“TSPO复合物”能够结合,影响TSPO的结构或者影响与其有相互作用的蛋白的结构,都可拮抗葛根素溶血。7.确定葛根素对红细胞呼吸和能量代谢的影响。通过检测以下四个指标,分别是总ATP含量、Na+-K+-ATP酶活性、ATP酶活性和NADH/NAD+比值,来反映葛根素诱导能量代谢情况。结果显示8 mmol/L葛根素处理红细胞后总ATP含量显著降低,Na+-K+-ATP酶的活性和ATP酶活性显著降低,NADH/NAD+比值显著升高。表明葛根素通过减弱Na+-K+-ATP酶活性和抑制糖酵解过程来减少ATP的产生,通过减弱ATP酶的活性抑制了ATP的消耗。提示红细胞的呼吸功能减弱,为氧化应激的发生提供了自由电子。选择抗氧化剂维生素C、维生素E和致氧化剂过氧化氢、柔红霉素;尿酸（抗硝化应激）和硝普钠（增强硝化水平应激）对红细胞进行预处理,结果显示它们都能拮抗葛根素溶血。表明溶血机制与氧化状态无关。提示维生素C、维生素E并不是通过抗氧化机制发挥的抗溶血作用。对葛根素处理的红细胞硝基化水平和亚硝基化水平进行检测,结果显示葛根素显著升高细胞硝基化水平和亚硝基化水平。表明葛根素溶血过程中伴随着细胞出现了硝化应激状态。8.以上结果表明,多种通道蛋白和膜蛋白参与了葛根素导致的红细胞溶血,且这些蛋白质发生相互作用。提示葛根素溶血以TSPO为靶点,增加了蛋白质的相互作用。以葛根素处理后TSPO与带3蛋白的相互作用为切入点,进行蛋白免疫共沉淀实验和质谱鉴定。结果显示,经葛根素处理后,与TSPO相互作用的蛋白的种类和数量,与带3蛋白有共同作用的蛋白复合物的种类和数量均有明显增加,并在质谱鉴定结果中找到了上述各靶点,验证了多种干预剂都能够显著拮抗溶血的结果。揭示葛根素致溶血作用是通过增加蛋白质相互作用发挥的,这些蛋白之间形成了十分庞杂的蛋白质相互作用网络。结论:葛根素致溶血机制如下:葛根素与红细胞膜上TSPO结合后,导致蛋白与蛋白之间的非特异性相互作用过度增加,引起结合蛋白结构改变、失活,细胞呼吸功能减弱,能量的生成出现障碍,细胞此时出现氧化应激和硝化应激,进一步损伤蛋白质,导致蛋白质释放和/或蛋白的降解,细胞骨架的解聚或胞内胶体渗透压升高,最终导致溶血现象的发生。