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查尔酮合成酶是黄酮类化合物合成途径中的关键酶,在很多生理生化活动中起着重要作用,CHS基因可以通过影响黄酮类化合物合成途径来影响植物的叶色,提高植物的抗逆性。本研究以白桦为试材,克隆查尔酮合成酶基因(BpCHS2、BpCHS3),利用农杆菌介导法获得转基因白桦,分析0.4%NaCl胁迫下转基因白桦生长及光合特性,研究结果如下: BpCHS3基因全长1203bp,编码400个氨基酸,蛋白质的相对分子量为99014.5,理论等电点为5.01,正负电荷残基数都为0,分子式为C3561H5921N1203O1480S304,消光系数为0,不稳定系数为46.03,脂肪系数为24.85,总平均亲水性为0.811,多序列比对发现,BpCHS2核酸序列与石榴、巨桉、莲等具有较高的相似性,相似性在76%~79%之间。 应用酶切技术构建白桦BpCHS2基因的植物过表达载体及抑制表达载体,通过农杆菌介导法的合子胚转化法开展白桦BpCHS的遗传转化,获得11个过表达株系,7个抑制表达株系,通过PCR、qRT-PCR和Northern杂交证明外源基因已经成功整合到白桦基因组内并在mRNA水平上能够表达。 对转BpCHS3基因株系的生长、内源激素及相关基因表达特性分析:与野生型白桦(WT)相比,BpCHS3过表达株系树皮变为无色,转基因株系分枝明显增多,分枝数为WT的1.25倍;BpCHS3过表达株系IAA与ABA含量均高于野生型白桦。 对2年生的BpCHS3过表达植株色素含量进行分析,结果表明:转基因植株的枝条上部和中部叶片中的叶绿素、类胡萝卜素的含量低于野生型白桦,转基因植株枝条下部叶片的叶绿素、类胡萝卜素均高于野生型白桦。转基因株系枝条下部叶片花色素苷的含量均低于野生型白桦1.35倍。在韧皮部:除了CHS3-1与CHS3-3上部叶绿素a含量低于野生型白桦,其他转基因株系上、中、下部位的韧皮部叶绿素a都高于野生型白桦。转基因植株各个部位叶片的类胡萝卜素含量均高于野生型白桦,其中转基因株系叶片中a/b含量均低于野生型白桦1.14倍,在花青素含量方面:转基因株系枝条上部和枝条下部叶片均低于野生型白桦,野生型白桦的花青素是转基因株系的1.21倍,大部分转基因株系韧皮部中部的花青素含量高于野生型白桦,野生型白桦的花青素是转基因株系的1.17倍。 对转基因株系在黄酮类化合物合成途径中相关基因时空表达情况分析,结果表明:BpCHS2、BpCHS3转基因株系的黄酮类化合物合成途径中相关家族基因含量大部分高于非转基因植株。BpCHSRi2、BpCHSRi3转基因株系的黄酮类化合物合成途径中相关家族基因表达量低于非转基因株系,其中BpCHS3转基因株系CHI和DFR的含量高于非转基因株系82.7和38.86倍,BpCHSRi3转基因株系CHI和DFR的含量低于非转基因株系0.45和0.46倍。 对BpCHS3转基因株系进行0.4%NaCl耐盐处理,测定其不同胁迫处理时间各株系的的相对生长量、叶绿素相对含量、叶绿素荧光参数及最大净光合速率,结果表明,在叶绿素荧光参数方面,NaCl胁迫9d时,大部分转基因株系Fv/Fm值仍在正常值范围内,与胁迫0d相比,转基因株系的qP和NPQ值的降幅也小于非转基因株系,分别为非转基因的1.73和1.25倍,而NPQ值却高于非转基因株系,为非转基因的0.61倍,以上研究证明,转基因株系表现出一定的耐盐能力。