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壳寡糖是由壳聚糖经生物酶、酸、微波等途径降解制备而成,因天然无毒、水溶性好、具有阳离子性质,且具抑菌、抗癌、抗氧化等活性,被广泛应用于医药、食品、农业等领域。其中壳二糖、壳三糖具有良好的抗氧化活性。目前,针对壳寡糖的活性研究基本是以不同聚合度壳寡糖混合物为原料开展的,壳寡糖单体之间因分子量相差小、结构类似,导致分离难度大,导致壳寡糖单体制备十分困难,壳寡糖单体的缺失限制了壳寡糖生理活性的准确探究,为大量获得高纯度的壳二糖、壳三糖单体,本研究通过酶解工艺优化结合离子交换树脂为色谱介质对壳聚糖酶解产物进行分离制备,研究了不同分离条件对分离效果的影响,为壳二糖、壳三糖的规模化制备及应用研究提供技术支持。 首先,建立了一种制备壳二糖、壳三糖混合组分的酶解方法。研究了专一性壳聚糖酶降解高脱乙酰度壳聚糖过程中反应温度、盐酸的添加量、底物浓度、酶添加量和反应时间的影响。结果表明,经120 h后,壳聚糖被降解成含壳二糖、壳三糖混合物。而当温度37℃、盐酸添加量与底物比例为0.48 mL/g、底物浓度为5%、酶添加量与底物比例为440.2 U/g降解效果最佳。高效液相色谱(HPLC)法分析发现,壳二糖、壳三糖占比分别为64.08%、35.14%,酶解得率达86.65% 其次,筛选了对壳二糖壳三糖吸附容量最高的树脂,并建立了壳二糖、壳三糖单体色谱分离的方法。采用静态吸附法测定了六种离子交换树脂的吸附容量。结果表明,强酸型阳离子交换树脂QY-H003对壳寡糖混合物的吸附容量最高,为91.70 mg/mL,作为分离介质。采用动态吸附洗脱法对壳二糖、壳三糖单体分离条件进行了研究,以制备的单体纯度及得率为比较指标。结果表明,以浓度梯度为1.25~1.55 mol/L的盐酸为洗脱剂,高径比为20∶1、流速V=2.0 mL/min、上样量与树脂体积比为60 mg/mL、温度为35℃,分离效果最佳。 再次,确定了壳三糖离子交换过程动力学方程。通过静态吸附实验研究了壳二糖、壳三糖的在QY-H003上的吸附等温线及动力学方程,采用动边界模型研究了壳三糖在QY-H003上的交换过程。考察了壳三糖浓度、温度及树脂粒径对交换过程的影响。结果表明,树脂对壳二糖、壳三糖的吸附过程更符合Langmuir模型,控制壳三糖在树脂上的交换速率步骤为颗粒扩散,反应级数为1.117,交换活化能Ea为10.47 kJ/mol,随着壳三糖浓度、温度的提高,交换速率变大,树脂颗粒越小,交换速率越快,交换过程的总速率常数为0.6020。 接下来,实施了壳二糖、壳三糖单体分离中试放大实验,并对制备的单体进行了结构表征与分析。在最佳条件下进行实验室中试分离实验,采用HPLC法分析制备的单体结果表明,壳二糖纯度为97.28%,壳三糖纯度为98.45%,两者得率分别为81.96%,89.86%。采用了TLC法、HPLC法对壳二糖壳三糖的纯度进行分析,TLC法结果表明,制备的两种单体与标准品中壳二糖壳三糖对应的比移值相同。HPLC图谱显示,制备的两组分分别与壳二糖、壳三糖标准品出峰时间相同,并采用FT-IR法与1HNMR法对制备的壳二糖壳三糖单体进行了结构表征。 最后,研究了壳二糖、壳三糖的体外抗氧化活性。不同浓度的壳二糖、壳三糖单体体外抗氧化活性实验结果表明,随着浓度的增加,壳二糖壳三糖单体对Fe3+的还原力及对羟基自由基、ABTS+自由基、DPPH自由基的清除能力均提高。在壳二糖、壳三糖单体浓度相同时,壳二糖的还原力及羟基自由基清除率强于壳三糖。而对ABTS+自由基和DPPH自由基的清除率壳三糖更高。浓度为2.0 mg/mL时,壳二糖、壳三糖羟自由基的清除能力分别为36.8%、32.0%。在浓度为800 ug/mL时,壳二糖壳三糖对ABTS+自由基的清除能力分别为32.52%、35.59%。DPPH清除率实验结果表明,当浓度为6.0 mg/mL时,壳二糖、壳三糖的清除能力分别为30.5%、35.8%。