研究目的对于终末期肾病患者而言,肾移植是理想的的替代疗法之一。尤其是近十年来,靶向T细胞的新兴免疫抑制剂的推广应用,显著降低了排斥反应的程度和发生频率,并由此延长了患者的寿命和提高了患者的生活质量,使得该替代疗法的应用更为广泛和有效。但是,长期过度的免疫抑制会增加感染、肿瘤及各种并发症发生的机会,反过来又会影响患者的生活质量和存活。因此,很有必要建立一套免疫监视系统,用来防止不必要的或过度的免疫抑制。随着机体的生理性衰老,免疫系统也随之逐渐发生退化,即免疫衰老。这个过程广泛影响到包括固有免疫和适应性免疫在内的所有成分,造成有效免疫应答能力下降或应答失败,导致机体易患各种感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病。在某些特殊的情形下,如机体持续暴露和对抗各种抗原和有害刺激时,免疫系统更易发生早衰,这种早衰是不依赖于生理性衰老的。衰老对免疫系统最显著的影响是T细胞发育和功能的受损,主要表现为初始T细胞的生成减少,记忆和效应T细胞的堆积和克隆扩增,对抗原刺激的增殖能力降低,细胞内的信号转导能力下降,产生有效的淋巴因子的能力受损等。从分子机制上来看,衰老的T细胞表现为缩短的端粒、降低的端粒酶逆转录酶(hTERT)表达水平及端粒酶活性。如上所述,T细胞是免疫抑制剂作用的主要靶点和免疫应答的核心成分。长期服用免疫抑制剂是否会造成T细胞的衰老?目前,对这一问题还不清楚。本研究以服用免疫抑制剂的肾移植长期存活患者为研究对象,以端粒和端粒酶为研究的切入点,通过对他们外周血中T细胞的各项指标进行分析,来探讨和阐明这一问题。研究方法1.肾移植患者和健康对照的选取。以54例服用免疫抑制剂的肾移植长期存活患者作为研究对象,中位年龄为48岁(25～68岁),肾移植时间≥4年,中位移植时间为5.5年(4～12.5年)。以年龄/性别匹配的54例健康个体作为对照。患者和健康对照的T细胞分别从他们的外周血中分离获得。2.RNA抽取和实时荧光定量PCR。应用ULTRASPECTM-ⅡRNA试剂盒提取T细胞的总RNA。cDNA合成过程中选用了逆转录酶M-MLV和随机引物六聚体(N6)。以β2-微球蛋白(β2-M)的表达作为RNA抽取、逆转录和PCR扩增的内参对照。实时荧光定量PCR实验在ABI7700 sequence detector机器上操作,应用SYBR Green荧光染料,以阈值循环数Ct值来计算hTERT和P16INK4amRNA的表达水平,以B2-M作为内参标准对照。3.流式细胞术。不同处理的T细胞分别被不同荧光标记的抗体染色。本研究中应用的抗体有CD3、CD4、CD8、CD25和CD28,实验中设置同型对照。经过孵育和漂洗后,应用贝克曼流式细胞仪对上述T细胞表面分子的荧光强度进行检测,采用Cell Quest软件对结果进行分析。4.细胞培养技术。体外培养的T细胞来源于肾移植患者和年龄/性别匹配的健康对照的外周血或者健康个体的buffy coats o使用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素、2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基,在温度为37℃、含5%CO2的孵箱里进行细胞培养。为了研究静息T细胞的活化增殖能力,在培养的T细胞中加入了致有丝分裂原成分刀豆蛋白(ConA,10μg/ml)。为了进一步探讨免疫抑制剂对T细胞的影响,在上述活化的T细胞中加入了临床常用的免疫抑制剂环孢素A (CysA)。根据实验设计的需要,ConA和不同浓度的CysA (2.5μM、10μM)可单独或共同孵育T细胞。5.DNA抽取和端粒长度测定。T细胞基因组DNA采用苯酚/氯仿的方法提取。采用实时荧光定量的方法测量端粒的长度。β-globin (HBG)的表达作为内参对照。端粒长度以T/S的比值来估计。6.端粒酶活性的测定。端粒酶活性的测定基于TRAP为基础的PCRELISA方法,采用罗氏公司的端粒酶PCR ELISA试剂盒,按照说明书进行操作。首先采用CHAPS裂解蛋白的方法提取细胞内蛋白质,后续PCR ELISA的实验中每一个样本的上样量为1μg蛋白。端粒引物的延伸步骤结束之后,进行28个循环的PCR扩增。通过过氧化物酶催化底物TMB发生的颜色变化来检测端粒酶的活性。以酶标仪上样本的吸光值OD450nm-690nn作为估计的指标。7.统计分析方法。肾移植患者和健康对照T细胞的hTERT表达水平、端粒酶活性、端粒长度、p161NK4α表达水平和T细胞表面分子表达之间的差异采用Student t-test。所有的检验均采用双尾检验法。P值小于0.05作为统计显著性的临界值。研究结果1.肾移植长期存活患者CD8+CD28-T细胞亚群百分比明显升高。本研究的54例患者中,除2例患者的外周血血常规结果未收集外,52例患者的白细胞计数和淋巴细胞计数显示：在白细胞计数中,除2例患者的计数略微升高,3例患者的计数略微降低外,其余47位患者的计数均在正常范围内；在淋巴细胞计数中,除2例患者的计数下降外,其余50例患者的计数均在正常的范围内。但是对T细胞亚群(CD3、CD4、CD8和CD28)进行流式细胞术分析的结果表明,与年龄/性别匹配的健康对照相比,肾移植患者T细胞CD8+CD28-亚群的比例显著增高。结果表明肾移植长期存活患者存在免疫早衰的迹象。2.肾移植长期存活患者T细胞的端粒长度明显缩短。端粒的长短经常被用来评估细胞有丝分裂的历史及衰老的现状。本研究采用实时荧光定量PCR的方法测量了肾移植长期存活患者和年龄/性别匹配的健康对照外周血T细胞端粒的长度。结果显示：与年龄/性别匹配的健康对照(1.139±0.100)相比,肾移植长期存活患者的端粒长度(0.983±0.100)明显缩短,差异具有统计学意义(P=0.043)。3.肾移植长期存活患者T细胞的端粒酶活性和hTERT的表达水平显著下降。为了探讨肾移植长期存活患者T细胞缩短的端粒长度是否与端粒酶的活性改变有关,我们采用以TRAP为基础的PCR ELISA方法,对肾移植长期存活患者和年龄/性别匹配的健康对照外周血中T细胞的端粒酶活性进行了测试。结果显示：肾移植患者T细胞的基础端粒酶活性水平(0.161±0.010)显著低于健康对照(0.242±0.020),差异具有统计学意义(P=0.008)。另外,活化的T细胞可以诱导端粒酶的活性,而T细胞的活化受到有丝分裂原或其他刺激物的调节。基于此,本研究进一步探讨了刀豆蛋白(ConA)对端粒酶活性的调节作用。结果表明：经ConA处理的肾移植患者的端粒酶活性(0.474±0.10)仍明显低于健康对照的端粒活性(0.743±0.130),差异具有统计学意义(P=0.045)。端粒酶是由多个亚单元组成的复合物,其关键成分人端粒酶逆转录酶(hTERT)作为催化亚基,控制和调节着端粒酶的活性。在T细胞中,hTERT的表达水平通常和端粒酶的活性程度保持一致。为了验证这一问题,我们应用实时荧光定量PCR的方法,对肾移植长期存活患者和年龄/性别匹配的健康对照的外周血中T细胞hTERT mRNA的表达水平进行了比较。结果显示：肾移植患者T细胞hTERT mRNA的表达水平(0.187±0.04)与健康对照hTERT mRNA的表达水平(0.335±0.007)相比,下降显著(P=0.025)。这似乎表明了肾移植患者T细胞下调的hTERT mRNA水平导致了端粒酶活性的下降。4.肾移植长期存活患者T细胞p16INK4αmRNA的表达水平显著上调。p16INK4α是细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制因子,也是肿瘤抑制因子,在端粒缩短和其他因素诱导的细胞衰老中扮演着关键的角色。本研究探讨了肾移植长期存活患者和年龄/性别匹配的健康对照外周血中T细胞P16INK4αmRNA的表达水平是否存在差异。实时荧光定量PCR的结果表明,肾移植患者T细胞P161NK4αmRNA的表达水平(2.068±0.360)显著高于健康对照组(0.950±0.034),差异具有统计学意义(P=0.005)。5.体外实验证明,免疫抑制剂环孢素A能下调经ConA活化的正常T细胞的端粒酶活性和hTERT的表达水平。在对肾移植患者外周血T细胞实验研究的基础上,本研究通过体外细胞培养实验进一步探讨了以下问题：免疫抑制剂对正常T细胞活化程度、端粒酶活性和hTERT表达水平的影响。从健康个体buffy coats中分离的T细胞在体外培养过程中,按照实验设计要求,分别单独加入刀豆蛋白(ConA)孵育或者与不同浓度的环孢素A (CysA)共孵育。首先,本研究探讨了CysA对ConA活化T细胞程度的影响。采用流式细胞术的检测方法,以T细胞表面分子CD25作为衡量T细胞活化程度的指标。结果表明：未经任何处理的T细胞在体外培养48小时后,仅有不到10%的细胞表达CD25分子；而加入ConA孵育48小时后的T细胞,则有近90%的细胞表达CD25分子；若同时加入CysA和ConA孵育48小时后,只有70.29%的T细胞表达CD25分子,与只加ConA组相比,下降明显。表明了免疫抑制剂对T细胞活化程度的下调作用。其次,本研究进一步探讨了经CysA介导的活化程度降低的T细胞端粒酶活性和hTERT表达水平的变化情况。结果表明,只加ConA活化后的T细胞端粒酶活性(0.317±0.071)和hTERT mRNA(6.690±1.948)表达水平显著升高,若同时加入不同浓度CysA后的T细胞,其端粒酶活性(10μM CysA:0.082±0.008；2.5μM CysA:0.094±0.016)和hTERT mRNA的表达水平(10μM CysA: 0.308±0.121；2.5μM CysA:1.174±0.163)均显著下降。总之,体内外实验的结果共同验证了免疫抑制剂对T细胞衰老的诱导作用。因此,很有必要建立一套免疫监视系统用来预防免疫系统过早的衰老。目前的研究结果虽然不能与临床应用建立即刻的联系,但是该研究结果提示我们在今后的临床实践中,可以通过分析上述指标来预测免疫系统衰老的程度,并根据此结果调整肾移植患者免疫抑制剂的用量,以提高该群体的生存质量。结论肾移植长期存活患者T细胞存在早衰的迹象,表现为缩短的端粒、下调的端粒酶活性和hTERT的表达水平、上调的p16ink4α的表达水平、以及明显升高的CD8+CD28-亚群的百分比。免疫抑制剂可能通过降低T细胞的活化程度和下调端粒酶的活性,导致了端粒的长度不断缩短,并最终诱导了T细胞的衰老。