结直肠癌是最常见的消化道肿瘤之一。有数据显示，在美国的恶性肿瘤中，结直肠癌的发病率占居第三位。在我国，结直肠癌发病率也呈上升趋势。临床上治疗结直肠癌主要以手术治疗为主，放、化疗为辅。但是，术后的复发、转移等问题以及化疗后出现的耐药、毒副作用等问题，给患者带来了二次伤害。所以，寻找新的治疗策略很有必要。　　靶向治疗已经在临床上广泛应用，但对于伴有BRAFV600E突变的结直肠癌患者仍无有效的靶向药物。研究发现，约有80％的恶性黑色素瘤为BRAF基因突变型。在结直肠癌中，约有12％-15％结直肠癌为BRAF基因突变型，而BRAFV600E基因突变占BRAF基因突变的90％以上。维罗非尼对BRAF突变的恶性黑色素瘤具有较好的疗效，而且药物耐受性较好，但维罗非尼对BRAF基因突变的结直肠癌疗效较差。研究表明，在结直肠癌中存在EGFR的负反馈调节机制。应用BRAF抑制剂之后，EGFR快速重新激活，从而增强细胞的生长、增殖、分化等生物学活动。而在恶性黑色素瘤中EGFR的表达水平低并且无EGFR负反馈通路。联合抗EGFR治疗可以对BRAF抑制剂增敏，但常需三种药物联合应用，这就限制了其在临床的应用。研究表明，肿瘤细胞对化疗及靶向药物的抵抗与c-Met的高表达有关。在结直肠癌中，c-Met的激活可使RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR信号途径激活。c-Met与BRAF基因之间可能存在互相的影响。但是，c-Met抑制剂联合维罗非尼治疗BRAFV600E结直肠癌迄今尚无报道。　　目的:探讨c-Met抑制剂PHA665752联合维罗非尼对BRAFV600E突变的结肠癌细胞系增殖的影响。　　方法:1、应用MTT法分别在24小时、48小时及72小时三个时间点检测1、1.5、2、2.5、3、3.5、4μM梯度浓度PHA665752对HT29、RKO细胞（均为BRAFV600E突变）增殖的影响。　　2、应用MTT法分别在24小时、48小时及72小时三个时间点检测0.01、0.1、0.5、1、3、6、9μM梯度浓度维罗非尼对HT29、RKO细胞增殖的影响。　　3、应用MTT法分别在24小时、48小时及72小时三个时间点检测PHA665752联合维罗非尼对HT29、RKO细胞增殖的影响。　　4、应用流式细胞术方法在48小时检测PHA665752联合维罗非尼对HT29、RKO细胞周期的影响。　　5、应用慢病毒转染法对HT29细胞进行BRAF基因敲低，建立敲低BRAF基因的HT29细胞。　　6、应用RT-PCR、Western blot方法检测敲低BRAF基因的HT29细胞BRAF基因的表达情况。　　7、应用MTT法分别在24小时、48小时及72小时三个时间点检测0.01、0.1、0.5、1、3、6、9μM梯度浓度维罗非尼对敲低BRAF基因后的HT29细胞增殖的影响。　　结果:1、PHA665752对HT29、RKO细胞增殖的影响。　　(1)HT29细胞应用PHA665752单药处理后，在24小时、48小时及72小时三个时间点，PHA665752浓度越大，对细胞增殖的抑制作用越明显(P＜0.01)。　　(2)RKO细胞应用PHA665752单药处理后，在24小时、48小时及72小时三个时间点，PHA665752浓度越大，对细胞增殖的抑制作用越明显，呈剂量依赖性(P＜0.01)。　　2、维罗非尼对HT29、RKO细胞增殖的影响。　　(1)HT29细胞应用维罗非尼单药处理后，24小时，3、6、9μM浓度维罗非尼对HT29细胞增殖有抑制作用(P＜0.05);48小时，0.1、0.5μM浓度维罗非尼对HT29细胞有促增殖作用（P＜0.05），9μM浓度维罗非尼对HT29细胞增殖有抑制作用(P＜0.05);72小时，0.5、1、3、6、9μM浓度维罗非尼对HT29细胞增殖有抑制作用（P＜0.05）。　　本结果提示:小剂量维罗非尼在短时间内对HT29细胞具有促增殖作用，大剂量维罗非尼对HT29细胞的增殖有抑制作用。　　(2)RKO细胞应用维罗非尼单药处理后，24小时，0.1、0.5μM浓度维罗非尼对RKO细胞有促增殖作用（P＜0.05），6、9μM浓度维罗非尼对RKO细胞增殖有抑制作用(P＜0.05);48小时，0.01、0.1μM浓度维罗非尼对RKO细胞有促增殖作用（P＜0.05），6、9μM浓度维罗非尼对RKO细胞增殖有抑制作用(P＜0.05);72小时，0.5、1、3、6、9μM浓度维罗非尼对RKO细胞增殖有抑制作用（P＜0.05）。　　本结果提示:小剂量维罗非尼在短时间内对RKO细胞具有促增殖作用，大剂量维罗非尼对RKO细胞增殖有抑制作用。　　3、PHA665752联合维罗非尼对HT29、RKO细胞增殖的影响。　　(1)PHA665752联合维罗非尼对HT29、RKO细胞增殖的抑制作用明显强于对照组、PHA665752单药组及维罗非尼单药组(P＜0.01)。　　(2)采用金正均Q值法评价两药联合应用是否有协同作用。　　24小时，2μMPHA665752联合各浓度维罗非尼组对HT29细胞增殖的抑制具有协同作用(Q＞1.15);48小时，2μM PHA665752联合1、3、6μM浓度维罗非尼组对HT29细胞增殖的抑制具有协同作用(Q＞1.15);72小时，2μM PHA665752联合各浓度维罗非尼组对HT29细胞增殖的抑制作用为单纯相加(Q值介于0.85-1.15)。　　24小时，1μM PHA665752联合1μM浓度维罗非尼组对RKO细胞增殖的抑制具有协同作用(Q＞1.15);48小时，1μM PHA665752联合各浓度维罗非尼组对RKO细胞增殖的抑制具有协同作用(Q＞1.15);72小时，1μMPHA665752联合各浓度维罗非尼组对RKO细胞增殖的抑制具有协同作用(Q＞1.15)。　　4、PHA665752联合维罗非尼对HT29、RKO细胞周期的影响。　　(1)HT29细胞周期:对照组的G0/G1期百分比为（52.33±5.13）％;PHA665752组的G0/G1期百分比为(55.33±6.66)％，两组无统计学意义（P＞0.05）;维罗非尼组的G0/G1期百分比为(67.00±6.93)％，大于对照组(P＜0.05); PHA665752联合维罗非尼组的G0/G1期百分比为(74.67±5.51)％，大于对照组及PHA665752组(P＜0.05)。　　(2)RKO细胞周期:对照组的G0/G1期百分比为（39.31±2.73）％;PHA665752组的G0/G1期百分比为(45.84±1.41)％，大于对照组(P＜0.05);维罗非尼组的G0/G1期百分比为41.08±2.71)％，与对照组无统计学意义(P＞0.05);PHA665752联合维罗非尼组的G0/G1期百分比为(65.58±2.81)％，大于对照组、PHA665752组及维罗非尼组（P＜0.05）。　　5、慢病毒转染法对HT29细胞进行BRAF基因敲低，成功建立敲低BRAF基因的HT29细胞。　　带有绿色荧光的细胞比例约70％，认为侵染效率达到转染要求，可进行后续检测实验。　　6、应用RT-PCR、Western blot方法检测慢病毒转染HT29细胞的BRAF基因表达情况。　　(1)在成功构建的4组慢病毒转染的HT29细胞中，4-S组BRAF基因的mRNA相对表达量最低（下降76％）（P＜0.05）。　　(2)在成功构建的4组慢病毒转染的HT29细胞中，4-S组的BRAF蛋白水平表达量最低（下降69％）（P＜0.05）。　　7、维罗非尼对敲低BRAF基因后的HT29细胞增殖的影响。　　敲低BRAF基因的HT29细胞应用维罗非尼单药处理后，24小时，3、6、9μM浓度维罗非尼对细胞的增殖有抑制作用(P＜0.05);48小时，0.01μM浓度维罗非尼对细胞有促增殖作用（P＜0.05），其余维罗非尼浓度组对细胞的增殖有抑制作用(P＜0.05);72小时，0.1、0.5、1、3、6、9μM浓度维罗非尼对细胞的增殖有抑制作用（P＜0.05）。　　HT29细胞和敲低BRAF基因的HT29细胞的MTT结果对比如下:　　应用维罗非尼处理24h后，维罗非尼浓度增大到9μM浓度时，HT29细胞和敲低BRAF基因的HT29细胞相比较，维罗非尼对HT29细胞的抑制率较小（P＜0.05）;应用维罗非尼处理48h和72h后，在0.1、0.5、1、3、6、9μM浓度维罗非尼组中，HT29细胞和敲低BRAF基因的HT29细胞相比较，维罗非尼对HT29细胞的抑制率较小（P＜0.05）。　　结论:1、PHA665752联合维罗非尼对HT29细胞、RKO细胞增殖的抑制具有协同作用。　　2、BRAFV600E突变是导致结肠癌细胞对维罗非尼抵抗的机制。