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目的本研究采用小鼠慢性不可预知应激模型(Chronic unpredictable stress,CUS),研究枸杞籽油(Lycium barbarum seed oil,LBSO)对慢性应激引起的抑郁样行为(Depression-like behavior)和认知能力障碍(Cognitive deficits)的影响;并以中枢海马(Hippocampus)为研究对象,以期揭示LBSO的应激保护作用是否涉及抑制海马神经元的损伤及BDNF信号通路的调制。方法采用小鼠慢性不可预知应激模型(Chronic unpredictable stress,CUS)。雄性ICR小鼠90只,适应性喂养3天后随机分为6组:正常组、模型组、阳性药物组(氟西汀,Fluoxetine,20mg/kg)、枸杞籽油低、中、高(2.5ml/kg,5ml/kg,10ml/kg)剂量组,每组15只,药物干预时间35天。除正常组群养于独立的实验室外,其余5组小鼠独笼饲养,并接受28天慢性不可预知刺激造模,这些刺激包括夹尾1 min、4℃冰水游泳刺激5 min、噪音刺激10 min、禁食禁水24h、束缚1h、足底电击5 min(30V,0.5Hz)、通宵照明、潮湿垫料。造模完成后所有小鼠依次接受旷场实验(Open field test,OFT)、悬尾实验(Tail suspension test,TST)、强迫游泳实验(Forced swim test,FST)、Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)四种行为学检验,共计7天。行为学检验完成后用4%水合氯醛麻醉小鼠,待角膜反射消失后眶丛取血,经离心后得血清用于Elisa法测定血清皮质酮含量。小鼠经取血后,分两种方式取材。每组10只小鼠取血后处死,开颅取海马,液氮速冻后转入超低温冰箱冻存。小鼠海马用于免疫印迹实验(Western Blot,WB),每组剩余小鼠心脏依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛,灌注完成后开颅取全脑,石蜡包埋后切片。脑切片用于组织形态学实验(包括HE染色和尼氏染色)和免疫组织化学实验(Immunohistochemistry,IM)。结果1.枸杞籽油对慢性应激小鼠抑郁样行为的影响:a.在旷场实验(OFT)中。与正常组相比,模型组小鼠穿越的格数降低(p<0.01);与模型组相比,氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠穿越的格数升高(p<0.01)。b.在悬尾实验(TST)中。与正常组相比,模型组小鼠的不动时间升高(p<0.05);与模型组相比,除枸杞籽油中剂量组无明显统计学差异外,各试验药物组小鼠的不动时间显著降低(p<0.01,p<0.05)。c.在强迫游泳实验(FST)中。与正常组相比,模型组小鼠的不动时间显著升高(p<0.01);与模型组相比,枸杞籽油低、中、高三个剂量组小鼠的不动时间均显著降低(p<0.01)。以上实验结果表明:枸杞籽油可改善慢性应激小鼠的抑郁样行为。2.枸杞籽油对慢性应激小鼠认知障碍的影响:a.在Morris水迷宫(MWM)的空间记忆采集实验中。与正常组相比,模型组小鼠的逃逸潜伏期显著升高(p<0.05);与模型组相比,氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠的逃逸潜伏期显著降低(p<0.01)。与正常组相比,模型组小鼠的平均潜伏距离显著升高(p<0.05);与模型组相比,除枸杞籽油中剂量组无明显统计学差异外,各试验药物组小鼠的平均潜伏距离显著降低(p<0.01,p<0.05)。空间记忆采集实验结果表明:枸杞籽油能缓解慢性应激小鼠的学习能力下降。b.在Morris水迷宫(MWM)的空间探索实验中。与正常组相比,模型组小鼠的原平台象限游程比率显著降低(p<0.01);与模型组相比,枸杞籽油高剂量组小鼠的原平台象限游程比率显著身高(p<0.05)。与正常组相比,模型组小鼠的原平台象限时间比率显著降低(p<0.01)。与模型组相比,各试验药物组与模型组的差异无统计学意义。与正常组相比,模型组小鼠的原平台有效穿越次数显著降低(p<0.01);与模型组相比,枸杞籽油高剂量组小鼠的原平台有效穿越次数显著升高(p<0.01)。与正常组在第三象限极有目的性的探索轨迹相比,模型组小鼠在整个迷宫中的探索是无倾向性、无目的性的。与模型组无目的性的轨迹相比,除枸杞籽油中剂量组无明显差异外,各试验药物组小鼠的探索轨迹有较强的目的性。空间探索实验结果表明:枸杞籽油可能缓解慢性应激小鼠的记忆障碍。3.枸杞籽油对慢性应激小鼠血清皮质酮的影响:在Elisa测定小鼠血清皮质酮的实验中。与正常组相比,模型组小鼠的血清皮质酮显著升高(p<0.01);与模型组相比,氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠的血清皮质酮显著降低(p<0.01、p<0.05)。Elisa结果表明:枸杞籽油可以改善慢性应激小鼠的血清皮质酮含量升高。4.组织形态学结果:a.HE染色结果:相比于正常组,模型组小鼠CA1区锥体细胞数量显著低于正常组(p<0.05)与模型组相比,氟西汀和枸杞籽油低、高剂量组小鼠的CA1区锥体细胞数量均显著高于模型组(p<0.05,p<0.01)。表明枸杞籽油可改善慢性应激小鼠的神经元细胞丢失。b.尼式染色结果:与正常组比较,模型组小鼠海马CA1区锥体细胞排列不规则,细胞间隙增大,细胞胞体内的尼氏小体减少或完全消失,细胞固缩。与模型组相比,氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠的CA1区锥体细胞排列整齐紧凑,其胞体内部的尼氏小体清晰可见。表明枸杞籽油可改善慢性应激小鼠的神经元损伤。5.免疫组织化学结果:a.BDNF:与正常组相比,模型组小鼠BDNF在海马组织CA1、CA3和DG三个区的表达较弱,BDNF的平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著降低(p<0.01)。与模型组相比,各试验药物组DNF在海马组织CA1和DG两个区的表达显著增强,BDNF的平均光密度在CA1和DG两个区均显著升高(p<0.01)。氟西汀组(20mg/kg)和枸杞籽油高剂量组在海马组织CA1、CA3和DG三个区的表达均显著增强。BDNF的平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著升高(p<0.01)。b.p-CREB:与正常组相比,模型组小鼠p-CREB在海马CA1、CA3和DG三个区的表达较弱。p-CREB的平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著降低(p<0.05、p<0.01),与模型组相比,除枸杞籽油中剂量组小鼠p-CREB只在海马CA1区表达显著增强;光密度显著升高(p<0.01)外。其余各实验组小鼠p-CREB海马CA1、CA3和DG三个区的表达均显著增强,平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著升高(p<0.01)。c.CREB磷酸化比率:与正常组相比,模型组小鼠CREB磷酸化比率在海马CA1、CA3和DG三个区均显著低于正常组。p-CREB/CREB在CA1、CA3和DG三个区均显著低于正常组(p<0.01、p<0.05)。与模型组相比,除枸杞籽油中剂量组小鼠CREB磷酸化比率只在海马CA1区显著上升;p-CREB/CREB显著升高(p<0.01)外。其余各实验组小鼠磷酸化比率在海马CA1、CA3和DG三个区均显著上升,p-CREB/CREB在CA1、CA3和DG三个区均显著升高(p<0.01)。6.Western blot结果a.BDNF:与正常组相比,模型组小鼠海马组织BDNF表达量显著降低(p<0.05);与模型组相比,氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织BDNF表达量显著升高(p<0.01)。b.p-CREB:与正常组相比,模型组小鼠海马组织p-CREB表达量与正常组无明显统计学差异;与模型组相比,枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织p-CREB表达量显著升高(p<0.05);氟西汀组无明显统计学差异。c.CREB:与正常组相比,模型组小鼠海马组织CREB表达量与正常组无明显统计学差异;与模型组相比,氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织CREB表达量均无明显统计学差异。d.CREB磷酸化比率:与正常组相比,模型组小鼠海马组织中的CREB磷酸化比率显著降低(p<0.05)。与模型组相比,氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织中的CREB磷酸化比率显著升高(p<0.05)。结论1.枸杞籽油具有改善慢性应激小鼠抑郁样行为和认知障碍的作用。2.枸杞籽油的应激保护作用涉及海马神经元的损伤的保护和BDNF信号通路的调制。