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N-糖酰胺酶是糖肽或糖蛋白研究中作用于N-链寡糖主要的工具酶,其作用是把N-糖链从所连接的多肽或蛋白质分子上解离下来进行分析,该酶被广泛用于糖链结构信息、糖链结构与功能关系、糖链对糖蛋白功能的影响以及蛋白质结构分析等方面的研究。PNGase H+是新发现的一种N-糖酰胺酶,该酶既能作用于糖肽,又能作用于糖蛋白,并且还能作用于含有α-1,3岩藻糖核心结构的N-链寡糖,关于该酶的研究相对较少。为了更深入地探究该酶的酶学特性,本文从N-糖酰胺酶PNGase H+最小糖单元酶切单位的角度出发,通过酶学方法合成不同糖单元大小的底物并将其用于对该酶最小糖单元作用底物的研究,同时将该酶应用于豆类植物糖蛋白N-链寡糖结构分析中,具体研究内容和结果如下:1.基于GNGN的不同糖单元大小底物合成研究合适的底物是酶活性检测和酶学特性研究的基础,本研究以GNGN(dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc4Man3)-Arg)和实验室的开发的各种外切糖苷酶为基础,利用β-N-Acety1-Hexosaminidase、α-Mannosidase、β-Mannosidase 通过逐步酶促反应得到了 dabsy1-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg、dabsy1-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man)-Arg、dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg、dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg 4 种底物。在此基础上以 dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg 为初始底物并利用β4GalT1、CGIUGE 通过一锅多酶法合成了 Dabsy1-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg 这一底物,共得到了 5种底物。2.基于合成底物的PNase H+最小糖单元作用底物研究以合成的5种底物为基础,研究PNGase H+的最小糖单元作用底物,合成的底物和GNGN一样都是带有氨基酸位点上紫外标记基团的,利用HPLC检测PNGaseH+与合成底物的反应发现 dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg、dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man)-Arg、dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg这四种底物上的糖单元能够被PNGase H+酶解,而底物(dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg上的糖单元则不能被酶解。从而得出PNGase H+能酶解糖单元数大于1的糖肽,而对糖单元数为1的糖肽则不起作用。3.PNGase H+在豆类糖链结构分析中的应用将PNGaseH+应用于红豆、黄豆、绿豆、黑豆四种豆类中糖蛋白糖链结构分析中,利用HPLC和MALDI-TOF-MS/MS相结合的方式对豆类中的N-连接寡糖进行结构解析。将MALDI-TOF一级质谱中的质荷比在Glycoworkbench软件中进行查询,可以得到其对应所有可能的结构。在此基础上,对寡糖结构进行MALDI-TOF二级质谱检测分析,同时对糖链结构进行相对含量定量分析。结合Glycobase数据库得到红豆与 绿豆 中 有 Man3GlcNAc2Xyl1、Man4GlcNAc2、Man3GlcNAc2Xyl1Fuc1、Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2 七种 N-链寡糖结构,红豆中其含量分别为3.3%、4.5%、3.6%、2.8%、19.2%、46.8%、19.8%;绿豆中其含量分别为 3.1%、4.6%、3.5%、2.7%、18.4%、47.3%、20.3%。黄豆与绿豆中有Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2三种N-链寡糖结构,黄豆中其含量分别为18.7%、26.5%、54.8%;黑豆中其含量分别为18.2%、26.3%、55.5%。比较发现红豆与绿豆中Man7GlcNAc2结构N-链寡糖百分含量为最高,黄豆与黑豆中Man8GlcNAc2结构N-链寡糖百分含量为最高。