目的:在乳酸乳球菌克隆表达嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ),并观察以lacZ基因作为食品级筛选标记的活性及筛选稳定性,为构建食品级表达载体奠定基础。方法:1.根据GenBank已报道的嗜酸乳杆菌ATCC4356-lacZ基因的DNA序列,利用PCR引物设计和分析软件,设计引物,扩增ATCC4356-lacZ基因,并将其克隆入乳酸菌表达质粒载体pMG36e中构建重组质粒pMG36e-lacZ,借助X-gal显色在大肠杆菌DH5α中筛选阳性克隆子。2.优化乳酸乳球菌MG1363的电转化条件,并在此条件下将重组质粒pMG36e-lacZ电转入MG1363中,借助X-gal显色筛选阳性转化子MG1363-lacZ以观察筛选活性。3. MG1363-lacZ在含乳糖的M17培养基中表达β-半乳糖苷酶,SDS-PAGE和native-PAGE分析蛋白表达和酶活性。通过X-gal显色筛选方法将重组菌株MG1363-lacZ传60代,并测定β-半乳糖苷酶酶活和比活力以观察X-gal筛选的稳定性。结果:1.成功构建了重组质粒pMG36e-lacZ,经PCR和酶切鉴定后与预期结果完全吻合。核酸序列测定显示插入的lacZ基因序列与预期结果亦相符。借助X-gal显色从大肠杆菌DH5α中成功筛选出阳性克隆子。2.优化了MG1363的电转化条件,确定了最佳参数:电压2kV,时间5ms。利用电转化成功地将重组质粒pMG36e-lacZ导入MG1363中,并借助X-gal显色成功筛选出阳性转化子MG1363-lacZ。3. SDS-PAGE结果显示,转化子MG1363-lacZ能表达约70kDa的蛋白,native-PAGE分析显示,该蛋白具有β-半乳糖苷酶活性。对借助X-gal传60代后的重组乳酸乳球菌进行β-半乳糖苷酶比活力检测,与X-gal筛选的第二代相比没有显著差异(P=0.596>0.05),与红霉素筛选比较也没有显著差异(P=0.882>0.05),表明lacZ基因作为筛选标记具有较好的活性和稳定性。结论:通过克隆表达ATCC4356-lacZ借助X-gal筛选方法从大肠杆菌DH5α和乳酸乳球菌MG1363中成功筛选出阳性克隆转化子。ATCC4356-lacZ基因作为筛选标记具有较好的活性和稳定性。本实验为以β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记的食品级载体的研究奠定了基础。