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流行性感冒(简称流感)是由流感病毒(Influenza Virus，IV)引起的急性呼吸道疾病，具有高度传染性、传播快、可跨种间传播等特点。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同组合，A型流感病毒(Influenza A Virus，IAV)可进一步分为许多亚型。1AV可以导致人和动物高发病率和死亡率，如新型重配禽流感病毒包括H7N9、H5N6、H7N7和H10N8会导致人类的零星致命性感染，对全球公共卫生安全和农业健康发展造成了极大的威胁。当前，结合基础研究研制新的疫苗和抗病毒药物应用于流感病毒的预防和治疗迫在眉睫。
当前有效防治流感病毒感染的主要方式是疫苗接种和使用抗病毒药物。目前流感疫苗存在对宿主保护有限以及对因抗原漂移或变异产生的新型流感病毒无效等问题。在临床上使用的抗流感药物主要以流感病毒神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻断剂为主，同时多种RNA聚合酶抑制剂获得批准用于治疗流感，但是这些药物存在副作用、有限疗效和耐药性等不足。临床上迫切需要开发针对新靶点和降低耐药性的新型抗流感药物，同时寻找参与病毒复制的关键宿主因子并将其作为抗病毒药物治疗的靶点这成为研究热点。
近年来通过高通量筛选以及基因敲除等遗传学手段发现Janus家族激酶(Janus kinases，JAK)JAK1和JAK2，在流感病毒复制过程中起重要作用。JAK1和JAK2基因沉默以及JAK激酶抑制剂可抑制流感病毒基因组的复制;此外，JAK2激活参与流感病毒颗粒的装配过程。这些研究结果提示JAK激酶可作为治疗流感病毒的药物靶点。本研究的目的是通过筛查临床上使用的药物以及筛选具有抗病毒活性的中草药成份寻找JAK激酶抑制剂并研究其抗病毒活性。
来氟米特(leflunomide)是一种免疫抑制剂类药物，主要用于治疗人类风湿性关节炎。该药物的活性代谢产物A771726能够抑制p70S6激酶(S6K1)、蛋白酪氨酸激酶活性以及通过抑制二氢乳清酸脱氢酶(DHO-DHase)活性来抑制嘧啶单核苷酸的合成。最近研究发现来氟米特除了抗炎和调节免疫功能外，还具有一定的抗病毒活性。但来氟米特是否具有抗流感病毒的活性仍未有报道，来氟米特抗病毒的分子机制存在很大争议。本实验室前期的工作发现A771726作为一种酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制淋巴细胞中JAK1和JAK3的活性。本研究旨在确定A771726是否可通过抑制JAK激酶活性来抑制流感病毒感染。
鉴于来氟米特是一类人工合成的小分子化合物，临床上可以长期使用，但对于少数病人仍具有一定的副作用。本研究的第二个切入点是从具有抗病毒活性的植物中寻找出JAK激酶抑制剂并将其开发为抗病毒药物;生姜在远古时代已用于治疗“热病”，具有抗病毒、细菌、真菌和线虫多种功效。研究发现生姜提取物可以抑制疱疹病毒、鼻病毒和呼吸道合胞病毒的复制。此外，生姜是治疗呼吸道感染的几种中药处方中的重要成分。迄今为止，有关生姜提取物中与其抗流感病毒活性有关的化合物的特性知之甚少。姜烯酮A(Gin A)是一种从生姜中提取的化合物，可作为JAK2和S6K1的双酶抑制剂。本研究的第二部分内容将探讨姜烯酮A能否通过抑制JAK2活性来抑制流感病毒感染。
1.来氟米特抗流感病毒感染的药物活性研究
为了研究来氟米特对流感病毒复制的影响及其分子机制，我们通过体外实验发现A771726能显著抑制A/mallard/Huadong/S/2005(H5N1)、A/PR/8/34(H1N1)和Ck/SH/F/98(H9N2)等IAV在鸡胚成纤维细胞(CEF)、人肺癌细胞系(A549)和犬肾细胞系(MDCK)中的复制。通过qPCR和Westernblot实验发现A771726能降低病毒基质蛋白(M1)的mRNA水平和病毒核蛋白(NP)、M1及血凝素(HA)的表达水平。同时，通过检测荧光素酶报告基因分析发现A771726能降低病毒Ribonucleoproteins(RNP)(PB2、PB1、PA和NP)聚合酶活性;与此相一致，体内试验发现来氟米特能减缓IAV感染小鼠体重减轻症状、延长小鼠存活时间，并且显著降低肺组织中的病毒载量和减轻小鼠肺脏病理损伤。为了进一步研究A771726对流感病毒复制的机理，通过Westernblot分析发现，S6K1抑制剂PF-4708671和单核苷酸合成抑制剂BrequinarSodium(BQR)不能抑制流感病毒的复制。而使用JAK特异性抑制剂Ruxolitinib(Rux)，能有效抑制流感病毒的复制。我们的研究进一步证明A771726抑制JAK1、JAK2和STAT3磷酸化。JAK2基因过表达促进了H5N1病毒的复制，并减弱了A771726的抗病毒活性。这些结果表明A771726具有抑制JAK2活性的能力，并且抑制JAK活性与其抗流感病毒活性密切相关。
2.姜烯酮A抗流感病毒感染的药物活性研究
JAK2在A型流感病毒复制中起重要作用。姜烯酮A(Gin A)作为一种生姜根部提取物，是JAK2和S6K1激酶的双酶抑制剂。为了研究姜烯酮A对流感病毒复制的影响及分子机制，通过体外试验发现姜烯酮A能显著降低A/mallard/Huadong/S/2005(H5N1)、A/PR/8/34(H1N1)和Ck/SH/F/98(H9N2)三种亚型的IAV在293T、MDCK、A549和DF-1细胞培养上清中的病毒滴度;同样地，体内试验进一步证明姜烯酮A可降低H5N1病毒感染小鼠肺组织中的病毒载量、改善小鼠体重减轻症状及延长小鼠的存活时间。我们进一步研究了姜烯酮A抗流感病毒感染的作用机制，通过qPCR和Westernblot分析发现姜烯酮A降低了病毒基质蛋白(M1)的mRNA水平，降低病毒碱性聚合酶2(PB2)、NP和M1的蛋白表达水平。此外，荧光素酶报告基因分析发现姜烯酮A能抑制病毒RNP聚合酶活性;以293T细胞为模型，发现JAK激酶特异性抑制剂(Rux)能有效抑制IAV复制，而S6K1特异性抑制剂PF-4708671对病毒复制没有影响。Rux和姜烯酮A均可以抑制JAK2自磷酸化和它的底物STAT3磷酸化。通过细胞转染试验，结果显示JAK2过表达促进H5N1病毒的复制，并减弱了姜烯酮A介导的抗病毒活性。综上所述，生姜提取物姜烯酮A通过抑制JAK2活性来抑制IAV复制，提示姜烯酮A可能成为一个具有新型抗流感病毒药物的潜力。
综上所述，本论文通过研究两种JAK家族激酶抑制剂，验证了JAK在流感病毒复制中具有重要作用，进一步证实JAK是一个重要的抗流感病毒的分子靶标。另外，本研究进一步阐明A771726抗病毒的药物机理，表明A771726通过抑制JAK酪氨酸激酶活性来发挥其抗病毒作用，其抗病毒活性与其抑制单核苷酸合成以及抑制S6K1激酶活性无关。最后，明确姜烯酮为生姜中的一个有效抗病毒活性的成份，并阐明姜烯酮通过抑制JAK激酶而不是S6K1激酶活性发挥其抗病毒活性。
来氟米特是一种临床上已经使用的抗类风湿性关节炎药物，且已有临床数据显示来氟米特具有抗CMV和BK病毒的疗效。姜烯酮来源于食材，预期副作用较低。鉴于此，我们预期这两种候选药物有望通过“老药新用”的绿色通道，快速进入临床试验，并用于治疗流感以及其它病毒性疾病如冠状病毒感染引起的新冠肺炎。
当前有效防治流感病毒感染的主要方式是疫苗接种和使用抗病毒药物。目前流感疫苗存在对宿主保护有限以及对因抗原漂移或变异产生的新型流感病毒无效等问题。在临床上使用的抗流感药物主要以流感病毒神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻断剂为主，同时多种RNA聚合酶抑制剂获得批准用于治疗流感，但是这些药物存在副作用、有限疗效和耐药性等不足。临床上迫切需要开发针对新靶点和降低耐药性的新型抗流感药物，同时寻找参与病毒复制的关键宿主因子并将其作为抗病毒药物治疗的靶点这成为研究热点。
近年来通过高通量筛选以及基因敲除等遗传学手段发现Janus家族激酶(Janus kinases，JAK)JAK1和JAK2，在流感病毒复制过程中起重要作用。JAK1和JAK2基因沉默以及JAK激酶抑制剂可抑制流感病毒基因组的复制;此外，JAK2激活参与流感病毒颗粒的装配过程。这些研究结果提示JAK激酶可作为治疗流感病毒的药物靶点。本研究的目的是通过筛查临床上使用的药物以及筛选具有抗病毒活性的中草药成份寻找JAK激酶抑制剂并研究其抗病毒活性。
来氟米特(leflunomide)是一种免疫抑制剂类药物，主要用于治疗人类风湿性关节炎。该药物的活性代谢产物A771726能够抑制p70S6激酶(S6K1)、蛋白酪氨酸激酶活性以及通过抑制二氢乳清酸脱氢酶(DHO-DHase)活性来抑制嘧啶单核苷酸的合成。最近研究发现来氟米特除了抗炎和调节免疫功能外，还具有一定的抗病毒活性。但来氟米特是否具有抗流感病毒的活性仍未有报道，来氟米特抗病毒的分子机制存在很大争议。本实验室前期的工作发现A771726作为一种酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制淋巴细胞中JAK1和JAK3的活性。本研究旨在确定A771726是否可通过抑制JAK激酶活性来抑制流感病毒感染。
鉴于来氟米特是一类人工合成的小分子化合物，临床上可以长期使用，但对于少数病人仍具有一定的副作用。本研究的第二个切入点是从具有抗病毒活性的植物中寻找出JAK激酶抑制剂并将其开发为抗病毒药物;生姜在远古时代已用于治疗“热病”，具有抗病毒、细菌、真菌和线虫多种功效。研究发现生姜提取物可以抑制疱疹病毒、鼻病毒和呼吸道合胞病毒的复制。此外，生姜是治疗呼吸道感染的几种中药处方中的重要成分。迄今为止，有关生姜提取物中与其抗流感病毒活性有关的化合物的特性知之甚少。姜烯酮A(Gin A)是一种从生姜中提取的化合物，可作为JAK2和S6K1的双酶抑制剂。本研究的第二部分内容将探讨姜烯酮A能否通过抑制JAK2活性来抑制流感病毒感染。
1.来氟米特抗流感病毒感染的药物活性研究
为了研究来氟米特对流感病毒复制的影响及其分子机制，我们通过体外实验发现A771726能显著抑制A/mallard/Huadong/S/2005(H5N1)、A/PR/8/34(H1N1)和Ck/SH/F/98(H9N2)等IAV在鸡胚成纤维细胞(CEF)、人肺癌细胞系(A549)和犬肾细胞系(MDCK)中的复制。通过qPCR和Westernblot实验发现A771726能降低病毒基质蛋白(M1)的mRNA水平和病毒核蛋白(NP)、M1及血凝素(HA)的表达水平。同时，通过检测荧光素酶报告基因分析发现A771726能降低病毒Ribonucleoproteins(RNP)(PB2、PB1、PA和NP)聚合酶活性;与此相一致，体内试验发现来氟米特能减缓IAV感染小鼠体重减轻症状、延长小鼠存活时间，并且显著降低肺组织中的病毒载量和减轻小鼠肺脏病理损伤。为了进一步研究A771726对流感病毒复制的机理，通过Westernblot分析发现，S6K1抑制剂PF-4708671和单核苷酸合成抑制剂BrequinarSodium(BQR)不能抑制流感病毒的复制。而使用JAK特异性抑制剂Ruxolitinib(Rux)，能有效抑制流感病毒的复制。我们的研究进一步证明A771726抑制JAK1、JAK2和STAT3磷酸化。JAK2基因过表达促进了H5N1病毒的复制，并减弱了A771726的抗病毒活性。这些结果表明A771726具有抑制JAK2活性的能力，并且抑制JAK活性与其抗流感病毒活性密切相关。
2.姜烯酮A抗流感病毒感染的药物活性研究
JAK2在A型流感病毒复制中起重要作用。姜烯酮A(Gin A)作为一种生姜根部提取物，是JAK2和S6K1激酶的双酶抑制剂。为了研究姜烯酮A对流感病毒复制的影响及分子机制，通过体外试验发现姜烯酮A能显著降低A/mallard/Huadong/S/2005(H5N1)、A/PR/8/34(H1N1)和Ck/SH/F/98(H9N2)三种亚型的IAV在293T、MDCK、A549和DF-1细胞培养上清中的病毒滴度;同样地，体内试验进一步证明姜烯酮A可降低H5N1病毒感染小鼠肺组织中的病毒载量、改善小鼠体重减轻症状及延长小鼠的存活时间。我们进一步研究了姜烯酮A抗流感病毒感染的作用机制，通过qPCR和Westernblot分析发现姜烯酮A降低了病毒基质蛋白(M1)的mRNA水平，降低病毒碱性聚合酶2(PB2)、NP和M1的蛋白表达水平。此外，荧光素酶报告基因分析发现姜烯酮A能抑制病毒RNP聚合酶活性;以293T细胞为模型，发现JAK激酶特异性抑制剂(Rux)能有效抑制IAV复制，而S6K1特异性抑制剂PF-4708671对病毒复制没有影响。Rux和姜烯酮A均可以抑制JAK2自磷酸化和它的底物STAT3磷酸化。通过细胞转染试验，结果显示JAK2过表达促进H5N1病毒的复制，并减弱了姜烯酮A介导的抗病毒活性。综上所述，生姜提取物姜烯酮A通过抑制JAK2活性来抑制IAV复制，提示姜烯酮A可能成为一个具有新型抗流感病毒药物的潜力。
综上所述，本论文通过研究两种JAK家族激酶抑制剂，验证了JAK在流感病毒复制中具有重要作用，进一步证实JAK是一个重要的抗流感病毒的分子靶标。另外，本研究进一步阐明A771726抗病毒的药物机理，表明A771726通过抑制JAK酪氨酸激酶活性来发挥其抗病毒作用，其抗病毒活性与其抑制单核苷酸合成以及抑制S6K1激酶活性无关。最后，明确姜烯酮为生姜中的一个有效抗病毒活性的成份，并阐明姜烯酮通过抑制JAK激酶而不是S6K1激酶活性发挥其抗病毒活性。
来氟米特是一种临床上已经使用的抗类风湿性关节炎药物，且已有临床数据显示来氟米特具有抗CMV和BK病毒的疗效。姜烯酮来源于食材，预期副作用较低。鉴于此，我们预期这两种候选药物有望通过“老药新用”的绿色通道，快速进入临床试验，并用于治疗流感以及其它病毒性疾病如冠状病毒感染引起的新冠肺炎。