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背景:瑞芬太尼是一种超短效的MOR阿片受体激动类药物,广泛应用于全身麻醉和重症监护室(ICU)患者的镇痛,然而瑞芬太尼可诱发术后痛觉过敏。术后疼痛是一个多因素、复杂的病理生理过程,而睡眠障碍是众多影响术后疼痛的因素之一。对于伴有慢性生理或心理疾病的患者,睡眠剥夺可增加患者术前疼痛的敏感性或者加重现有的病理性疼痛。虽然已有研究表明睡眠剥夺会影响术后疼痛,然而具体为何种机制影响疼痛以及睡眠剥夺对术后瑞芬太尼痛觉过敏的患者是否有影响都尚不清楚。因此,本研究旨在探究睡眠剥夺对瑞芬太尼痛觉过敏的影响和作用机制。方法:1.构建不同的睡眠剥夺动物模型和瑞芬太尼痛觉过敏的动物模型。急性睡眠剥夺模型,大鼠分别连续剥夺6小时,9小时,12小时和24小时;慢性睡眠剥夺模型,大鼠每天睡眠剥夺6小时,连续剥夺5天;瑞芬太尼痛觉过敏模型,大鼠尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,泵注1小时。利用机械刺激缩足阈值PWT和热刺激缩足阈值PWL检测大鼠急性睡眠剥夺、慢性睡眠剥夺以及睡眠剥夺合并瑞芬太尼痛觉过敏的疼痛行为学改变。2.利用高尔基染色及透射电镜检测大鼠脊髓背角突触可塑性的改变;并采用Western Blot技术检测睡眠剥夺-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角Sema3G、Npn2、m Glu A1和t Glu A1的表达变化。3.鞘内注射NASPM后应用PWT和PWL检测疼痛行为学变化;利用高尔基染色检测使用NASPM后大鼠脊髓背角树突棘改变;采用Western Blot技术检测应用NASPM后大鼠脊髓背角Sema3G、Npn2的表达变化。4.应用Npn2-siRNA下调Npn2后利用PWT和PWL检测疼痛行为学变化并采用Western Blot技术检测大鼠脊髓背角Sema3G、m Glu A1和t Glu A1的表达变化。5.采用Sema3G-siRNA抑制Sema3G表达后应用PWT和PWL检测疼痛行为学变化并采用Western Blot技术检测大鼠脊髓背角Npn2、m Glu A1和t Glu A1的表达变化。结果:1.建立大鼠急性睡眠剥夺模型,分别对大鼠连续剥夺6小时,9小时,12小时和24小时。大鼠急性睡眠剥夺行为学结果显示:急性睡眠剥夺后各组之间的基线水平无统计学差异(P>0.05);且大鼠进行24小时的恢复性睡眠后各组PWT和PWL均恢复到基线水平,组间无统计学差异(P>0.05)。此外,睡眠剥夺后1小时检测各组之间疼痛阈值发现,与Control组相比ASD6h组PWT和PWL无明显改变(P>0.05),但是ASD 9h组,ASD 12h组和ASD 24h组PWT和PWL疼痛阈值显著降低(P<0.05),随着睡眠剥夺时间增加PWT和PWL下降更加明显(P<0.05)。2.建立大鼠慢性睡眠剥夺模型,每天睡眠剥夺6小时,连续剥夺5天。疼痛行为学结果显示:慢性睡眠剥夺各组基线水平无统计学差异(P>0.05),且慢性睡眠剥夺3天不影响PWT和PWL阈值(P>0.05),从第4天开始PWT和PWL阈值逐渐下降(P<0.05),产生机械痛敏和热痛敏。3.为明确急性睡眠剥夺和瑞芬太尼痛觉过敏之间的关系,根据前期研究结果本组实验中我们首先建立睡眠剥夺12小时的急性睡眠剥夺模型,再构建瑞芬太尼痛觉过敏模型。该部分研究结果显示:与C组相比,R组、ASD组和R+ASD组在输注瑞芬太尼或生理盐水前24h PWT和PWL基线阈值无统计学差异(P>0.05);在输注瑞芬太尼或生理盐水后2h和6h PWT和PWL阈值显著下降(P<0.05);但ASD组在输注生理盐水6h后PWT和PWL阈值上升(P<0.05),且在24小时恢复到基线水平(P>0.05)。与R组相比,R+ASD组在输注瑞芬太尼2h后PWT和PWL阈值降低(P<0.05),6h和24h后PWT和PWL疼痛阈值均无统计学差异(P>0.05),说明急性睡眠剥夺对瑞芬太尼痛觉过敏的大鼠仅在术后2h有一过性的影响。4.为了进一步探究短期慢性睡眠剥夺对瑞芬太尼痛觉过敏的影响,我们采用短期慢性睡眠剥夺的方式,每天剥夺6h,连续剥夺3天。研究结果显示:与C组相比,CSD组PWT和PWL的疼痛阈值与之无统计学差异(P>0.05);R组和R+CSD组PWT和PWL阈值降低(P<0.05)。与R组相比,R+CSD组PWT和PWL阈值恢复到基线水平的时间延长,说明短期慢性睡眠剥夺可延长瑞芬太尼痛觉过敏大鼠的恢复时间。5.为了检测睡眠剥夺-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角树突棘和突触结构的改变,本研究应用高尔基染色技术和透射电镜技术。高尔基染色结果显示:与C组相比,R组和R+CSD组树突棘的数量和密度显著增多(P<0.05),而CSD组并无统计学差异(P>0.05)。与R组相比,R+CSD组树突棘数量增多,具有统计学意义(P<0.05)。此外,透射电镜结果显示:与C组相比,R组和R+CSD组突触后膜显著增厚(P<0.05),而CSD组与C组相比并无统计学差异(P>0.05),该结果与高尔基染色树突棘变化一致。且与R组相比,R+CSD组突触后膜增厚程度更为明显(P<0.05)。6.为了探究睡眠剥夺-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠突触可塑性改变的可能机制,应用Western Blot实验技术检测大鼠脊髓背角相关指标的变化。实验结果显示,与C组相比,SD组Sema3G、Npn2、m Glu A1和t Glu A1表达水平无统计学差异(P>0.05);R组和SD+R组Sema3G、Npn2、m Glu A1和t Glu A1表达水平增加(P<0.05)。与R组相比,SD+R组Sema3G、Npn2、m Glu A1表达水平增加(P<0.05);但增t Glu A1表达水平无统计学差异(P>0.05)。7.鞘内注射Glu A1抑制剂NASPM后,与Baseline相比,Control+Saline组和Control+NASPM组PWT和PWL阈值无统计学差异(P>0.05)。与Control+Saline组相比,CSD+Remi+Saline组和CSD+Remi+NASPM组PWT和PWL阈值降低(P<0.05);与CSD+Remi+Saline组相比,CSD+Remi+NASPM组PWT和PWL阈值升高(P<0.05)。高尔基染色结果显示,与CSD+Remi+Saline组相比,CSD+Remi+NASPM组树突棘数量减少(P<0.05),说明特异性抑制Glu A1表达,可以有效下调树突棘的数量。Western Blot结果显示,与CSD+Remi+Saline组相比,CSD+Remi+NASPM组Sema3G和Npn2表达无差异(P>0.05)。8.鞘内注射Npn2-siRNA后,与Baseline相比,Control+LV-negative Control组和Control+Npn2-siRNA组PWT和PWL无统计学差异(P>0.05)。与Control+LV-negative Control组相比,Control+Npn2-siRNA组PWT和PWL与之无统计学差异(P>0.05);CSD+Remi+LV-negative Control组PWT和PWL阈值显著降低(P<0.05)。与CSD+Remi+LV-negative Control组相比,CSD+Remi+Npn2-siRNA组PWT和PWL阈值升高(P<0.05)。Western Blot结果显示,鞘内注射Npn2-siRNA后,与CSD+Remi+LV-negative Control组相比,CSD+Remi+Npn2-siRNA组Sema3G和t Glu A1表达无差异(P>0.05),m Glu A1及m Glu A1/t Glu A1的表达下降(P<0.05)。9.鞘内注射Sema3G-siRNA后,与Baseline相比,Control+LV-negative Control组和Control+Sema3G-siRNA组PWT和PWL之间无统计学差异(P>0.05)。与Control+LV-negative Control组相比,CSD+Remi+LV-negative Control组PWT和PWL阈值显著降低(P<0.05)。与CSD+Remi+LV-negative Control组相比,CSD+Remi+Sema3G-siRNA组PWT和PWL阈值升高(P<0.05)。Western Blot结果显示,鞘内注射Sema3G-siRNA后,与CSD+Remi+LVnegative Control组相比,CSD+Remi+Sema3G-siRNA组t Glu A1表达水平均无统计学差异(P>0.05);CSD+Remi+Sema3G-siRNA组Sema3G和m Glu A1表达下降(P<0.05)。结论:1.急性睡眠剥夺后PWT和PWL值均降低,且随着睡眠剥夺时间增加大鼠的疼痛反应更加明显,但是大鼠经过24小时恢复性睡眠后机械痛阈和热痛阈均可恢复到基线水平。此外,以1μg·kg-1·min-1速度输注瑞芬太尼1小时产生瑞芬太尼痛觉过敏,并且急性睡眠剥夺能够加重瑞芬太尼痛觉过敏,但是在24小时恢复性睡眠后疼痛阈值可恢复到基线水平,且不再影响瑞芬太尼痛觉过敏。2.短期慢性睡眠剥夺3天PWT和PWL无改变,不影响疼痛阈值。慢性睡眠剥夺第4天开始疼痛阈值降低,产生机械痛敏和热痛敏,且第5天阈值最低。短期的慢性睡眠剥夺虽然并未降低术后24h和48h的疼痛的阈值,但是却延长了瑞芬太尼痛觉过敏大鼠的恢复时间。3.短期慢性睡眠剥夺虽然不影响树突棘可塑性的改变,但是可诱导瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角树突棘数量增加、突触后膜增厚,进而加重瑞芬太尼痛觉过敏。并且睡眠剥夺调节瑞芬太尼痛觉过敏大鼠突触可塑性改变的机制是由于AMPA受体-Glu A1亚基向突触后膜转运增加,以及Npn2和Sema3G表达的增加。4.NASPM可特异性的降低AMPA受体-Glu A1亚基的表达。NASPM可有效改善睡眠剥夺-瑞芬太尼痛觉过敏、缩短疼痛恢复时间,同时该药物不影响空白对照大鼠的阈值。使用NASPM特异性的降低m Glu A1可有效减少树突棘的数量,调节突触可塑性。且鞘内注射NASPM后不影响睡眠剥夺-瑞芬太尼大鼠Npn2和Sema3G的表达,表明抑制Glu A1不改变Npn2和Sema3G的表达水平。5.下调大鼠脊髓背角Npn2的表达后可以提高睡眠剥夺-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠的PWT和PWL阈值,改善疼痛状态、缩短恢复时间。虽然下调Npn2表达后不影响Glu A1总蛋白的表达,但是可以下调睡眠剥夺-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠膜转运水平。且抑制Npn2后不影响睡眠剥夺-瑞芬太尼大鼠Sema3G的表达。6.抑制大鼠脊髓背角Sema3G的表达水平可以有效改善睡眠剥夺-瑞芬太尼机械性痛觉过敏和热痛敏,缩短疼痛的恢复时间。抑制Sema3G后改善睡眠剥夺-瑞芬太尼大鼠痛觉过敏的机制是抑制Sema3G可以下调Npn2的表达水平,进而调节Glu A1的膜转运水平。因此,在睡眠剥夺-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠中Sema3G通过Npn2调节AMPA受体Glu A1亚基的膜转运。