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杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是我国特有的一种名贵中药材,其具有双向调节血压、增强细胞免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老、降低血糖、调节血脂等多方面的功效。相关研究发现,杜仲中具有药理活性的木脂素类化合物的糖苷结构尤为重要。糖基转移酶(Glucosyltransferase,GT,EC2.4.x.y)催化糖苷取代反应,能够将糖基从活化的糖供体转移至特定的受体。糖基化可以增强植物次生代谢物的稳定性和水溶性,在各种植物生理功能中起重要作用。本研究从杜仲转录组数据库筛选并克隆出一个注释为糖基转移酶的基因EuCGT2。为研究该基因的功能及该基因对杜仲次生代谢产物的影响,对EuCGT2基因进行生物信息学和时空表达分析,构建原核表达载体转化大肠杆菌,构建植物过表达载体遗传转化杜仲,取得如下结果: 1EuCGT2基因的克隆及生物信息学分析 本研究利用实验室前期构建的杜仲转录组注释数据库,设计特异性引物,克隆了长度为285bp的EuCGT2基因序列。分析表明,该基因序列间存在1个glyco tranf GTA结构域,属于糖基转移酶家族。EuCGT2基因的开放阅读框长285bp,编码94个氨基酸,分子量为11.2kDa左右。理论等电点(pI)值为7.88,属疏水性稳定蛋白,无信号肽,不存在跨膜结构域。蛋白质二级结构包括α-螺旋、无规则卷曲和延伸链。EuCGT2在进化过程中与黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)glycosyltransferase6的亲缘关系较近。 2EuCGT2基因时空表达分析 利用实时荧光定量PCR对杜仲幼苗及成熟植株的根茎叶中EuCGT2基因的表达量进行测定,结果表明,EuCGT2基因在杜仲幼苗中的表达量较低,在成熟杜仲植株茎中的表达量最高。 3EuCGT2基因的原核表达及重组蛋白纯化 EuCGT2蛋白分子量较小,易形成包涵体,故本研究选取了带促溶标签MBP的原核表达载体pMCSG19,增加了蛋白可溶性表达。利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuCGT2并转化到E.coli Rosetta(DE3)中,37℃条件下,加入0.05mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6h,EuCGT2重组蛋白在大肠杆菌中以部分包涵体、部分可溶性蛋白的形式获得了表达,从上清中纯化获得了EuCGT2重组蛋白,经质谱得到鉴定。 4EuCGT2基因过表达载体遗传转化 构建了EuCGT2基因过表达载体pSH737-35S-EuCGT2,农杆菌介导法进行了杜仲遗传转化,对获得的抗性芽进行GUS染色,证明EuCGT2基因成功转入杜仲基因组中,获得了34个抗性芽。