遗传性视网膜变性是一类常见难治的遗传性致盲眼病,这其中最常见的有视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP),最严重的是Leber先天性黑朦(Leber congenital amaurosis,LCA),具有高度遗传异质性和临床表型多样性。迄今报道至少有253个基因被发现与遗传性视网膜变性相关(Ret Net网站:https://www.sph.uth.edu/Ret Net),其中82个与RP有关。由于致病基因众多,以及视网膜变性遗传学和表型的高度异质性,目前此类疾病的基因诊断存在极大困难。测序技术的限制使以往遗传性眼病的分子遗传学研究以单基因家系研究为主,鲜有对所有遗传性视网膜变性已知基因全面系统分析的研究。随着测序技术的迅猛发展,越来越多的研究者使用高通量测序分析遗传病的发病原因。虽然高通量测序可以克服技术瓶颈在短时间内获得大量序列变异,但测序得到的数据量和复杂性也随之增加,给变异的注释和致病突变的确定带来了新的挑战。本研究旨在全面系统分析常见遗传性视网膜变性患者Ret Net基因变异,可以对疾病的分子遗传学病因有一个系统的了解。本研究基于高通量测序大数据的分析发现并总结以往研究忽视的一些可能不致病的基因和变异,提醒后续的基因研究注意。本课题在课题组已有病例的全外显子组测序数据基础上,一方面系统分析了157例RP患者Ret Net基因的突变情况;另一方面,在既往系列研究基础上,系统总结了一组LCA病例Ret Net基因突变频谱,同时对个别基因变异进行了进一步分析。在近60%的RP和LCA先证者中发现潜在致病突变,总结了Ret Net基因在这两种常见的遗传性视网膜变性疾病中的突变频谱和频率。发现ALMS1基因不仅与Alstr?m综合征相关,还可以作为早发重型视网膜变性先证者的候选基因。基于对近千例遗传性视网膜变性患者外显子测序结果的分析,总结了高通量测序在眼遗传病致病基因突变寻找过程中遇到的常见问题,包括在眼遗传眼病先证者全外显子组测序结果中发现频率大于1%且Human Gene Mutation Database报道致病的突变;经生物信息学预测致病的变异,也可以同时并存于不同遗传眼病中,或无法在家系共分离分析中得到验证。研究提示了人类基因的复杂性,以及分析眼遗传病高通量测序的结果时需要结合临床多方面多角度综合分析,确定变异致病性时需要谨慎。本研究为进一步开展遗传性视网膜变性疾病的基因诊断奠定基础,也为这类疾病的预防、治疗措施,及新基因的寻找提供线索。第一部分Ret Net基因突变在视网膜色素变性先证者中的频谱分析目的:本研究基于157例视网膜色素变性先证者全外显子组测序数据,系统分析了Ret Net基因的突变频谱和频率。总结在高通量测序分析遗传性视网膜变性致病基因突变过程中面临的困难和解决策略。方法:分析157例RP先证者DNA全外显子组测序数据,对Ret Net(2014年1月)中191个基因(包括62个RP已知基因和129个其他类型遗传性视网膜变性基因)的变异通过频率、功能预测、对照分析和家系共分离分析等一系列方法分析确定可能的致病突变并由Sanger测序验证。结合课题组先前的研究,总结Ret Net基因突变在157例RP先证者中突变频谱和频率。结果:分析157个RP先证者全外显子组测序数据中的Ret Net基因突变,共在90个(57.3%,90/157)家系中发现潜在致病突变,其中在79个家系中发现28个RP已知基因的突变,以及在11个家系中发现5个其他类型视网膜变性基因突变。检出突变的90个家系中包括31(34.4%,31/90)个家系携带常染色体显性基因的杂合突变,41(45.6%,41/90)个家系携带常染色体隐性基因的纯合突变(10)和复合杂合突变(31),18(20.0%,18/90)个家系携带X连锁基因的半合突变。在分析828个遗传眼病全外显子组测序数据时,发现Human Gene Mutation Database列出的致病突变中,有27个在我们所有遗传眼病人群中等位基因频率超过1%,分布在24个基因(12个综合征基因和12和Ret Net基因)中。14个显性Ret Net基因生物信息学预测致病的变异同时在不同疾病患者中发现。Ret Net基因预测致病变异在16个家系中发现不符合家系共分离。结论:通过全外显子组测序,有57.3%的RP先证者在Ret Net基因中发现潜在致病突变。本研究不仅系统分析了中国RP患者全部视网膜变性已知基因突变频谱和频率,而且提供了中国RP患者分子病因的概述。对已知基因的分析为进一步发现新的RP致病基因提供了基础和线索。本研究总结了高通量测序分析遗传性视网膜变性致病基因突变过程中面临的困难和解决策略,列举了Ret Net基因突变可能不致病的基因和变异,提示在分析高通量测序突变数据时需要结合临床多方面多角度分析。第二部分Ret Net基因突变在视网膜色素变性相关疾病先证者中的频谱分析目的:全面分析159个中国LCA先证者Ret Net基因的突变频谱和频率。进一步发现LCA新的致病基因。另外,在46个中国高度远视先证者中筛查高度远视合并RP的致病基因——MFRP的突变。方法:基于159例LCA先证者全外显子组测序数据,对191个Ret Net基因(截止于2014年1月,包括62个RP已知基因和129个其他类型遗传性视网膜变性基因)存在的变异,进行频率、功能预测、对照分析和家系共分离分析等一系列分析,确定可能的致病突变并由Sanger测序验证。由于意外发现ALMS1存在高频无效突变,所以进一步扩大样本量,分析了1220个遗传性眼病患者的ALMS1基因变异,发现了多个ALMS1无效突变,进行Sanger测序验证、家系共分离分析和对照分析,在回访中检查患者其他全身综合征症状表现。在42个高度远视先证者利用全外显子组测序分析MFRP突变,另外4个先证者通过Sanger测序分析MFRP编码序列,进一步在家系成员和192个正常对照中进行候选变异分析。结果:159个LCA先证者中,有90个发现了Ret Net基因的可能致病突变,占总人数的56.6%。其中72个只进行全外线组测序分析的患者中,有45个(62.5%)发现携带突变。突变频率最高的几个基因分别是GUCY2D(10.7%)、CRB1(7.5%)、CEP290(6.9%)、RPGRIP1(5.0%)、IQCB1(4.4%)、ALMS1(3.8%)和CRX(3.8%)。在1220个遗传眼病患者中,11个LCA和早发重型锥杆细胞营养不良(cone-rod dystrophy,CORD)先证者发现携带13个ALMS1无效突变,这11个携带ALMS1无效突变的先证者在总数为215例的LCA和CORD中占5.1%(11/215)。15个患者中的9个通过回访检查发现Alstr?m综合征的全身症状缺失或表现轻微。在3个高度远视先证者中发现可能致病的复合杂合突变。临床资料显示这些患者屈光度至少有+13.50D或眼轴最长为16.78mm。视网膜电图显示携带错义突变的患者视锥视杆细胞反应正常,另一个携带错义和截短突变的患者视杆细胞反应降低,并伴有黄斑囊样变性。结论:一系列的突变研究分析发现Ret Net已知基因突变可以解释56.6%的中国LCA先证者患病原因。本研究对中国LCA患者种族特异性的已知基因突变频谱和频率进行了全面的分子遗传学分析。提示ALMS1应该作为LCA或早发重型CORD的先证者的候选基因,眼部异常可能是综合征最早发最明显的症状。本研究扩展了MFRP的突变频谱和其相关表型,这是在中国人群中首次报道MFRP突变。