随着哺乳动物细胞体外培养技术的发展,人们在细胞、组织以及器官水平上对生命功能的理解有了众多突破性的重要进展。然而,大多数的研究结果都是建立在传统的2D培养技术上,这和生物体内复杂的3D环境是不相符的。在体内,细胞的3D排列决定了体内环境的特异性并在一定程度上决定了细胞所组成的器官的功能。因此,发展体外3D培养技术在当今细胞生物学的研究中就显得尤为重要。近年来,生成由多个细胞自组装而成的细胞球作为体外3D培养的方法之一,由于具有模拟体内组织结构和功能的特征,已被广泛应用于诸如药物筛选和癌症治疗等领域的研究中。另外,由多个细胞融合而成的非球形细胞团,做为组织构建的结构单元在组织工程的应用中也展现出了巨大的潜力。然而,现有的细胞球和细胞团生成方法却存在着诸多缺点,制约着细胞球和细胞团的应用发展。本研究以微流控液滴技术为支撑,设计并制作了两种能产生不同包裹细胞的凝胶液滴的微流控芯片,通过与不同的凝胶化方式相结合,实现了在不同的凝胶微球中具有均一尺寸的细胞球和形状可控的细胞团的生成,为体外3D细胞培养提供了新的思路和方法。本研究所得到的结果如下:1.本研究通过对前烘条件、曝光时间和显影时间的探索,成功制作出管道结构完整的模版;在此基础上,通过控制PDMS预聚物和固化剂比例、固化温度以及固化时间,制得机械性能良好且结构完整的由细胞分散单元和液滴生成单元所构成的流聚焦型微流控液滴芯片。结果显示:制作模版时最佳前烘条为件65°C 2 min+95°C 4 min、曝光时间为75s、显影时间为4min;制备芯片时的最佳条件为:预聚物和固化剂比例为7:1、固化温度为85°C、固化时间为40min。利用该芯片实现了不同大小的液滴均一稳定地产生,并且利用荧光素证明了通过改变水相流速比能实现对生成的混合液滴成分的在线控制,为混合凝胶微球中细胞球的生成奠定了基础。2.通过在线控制微流控芯片中水相的流速,对生成混合凝胶微球的海藻酸钠和基质胶的使用比例进行了筛选,得到1:1为最优比例,并在此条件下生成了混合凝胶微球进行He La细胞包裹及培养,得到了具有良好细胞活力且形状和大小均一的肿瘤细胞球。通过对细胞骨架进行染色观察,证明生成的肿瘤球细胞之间相互连接紧密,形成了良好的3D细胞与细胞间的连接。抗肿瘤药物测试说明了生成的肿瘤球中的细胞比普通单层培养的细胞具有更强的抗药性。3.利用Auto CAD软件设计了具有细胞分离单元和液滴形成单元的流聚焦型微流控液滴芯片并用多层软刻蚀技术制作了由流动层、PDMS薄膜和载玻片组成的符合试验要求的PDMS芯片。利用该芯片,形成了包裹细胞的海藻酸钠液滴。通过与芯片外的凝胶化方法相结合,实现了用于细胞包裹和培养的海藻酸钙凝胶微球的均一生成,并且通过细胞培养得到了具有高细胞活力的细胞团。通过改变海藻酸钠和Ca Cl2的浓度,实现了在海藻酸钙凝胶微球中形成具有类球形、棒状和树枝形等不同形状的He La、Hep G2和HUVEC细胞团,证明本研究所采用的形成细胞团的方法具有可控性和普遍适用性。4.通过细胞骨架染色和扫描电镜观察证明了生成的细胞团形态结构完整,细胞与细胞之间连接紧密。通过加入柠檬酸钠与Ca2+发生螯合作用,将海藻酸钙凝胶微球液化,快速释放出其内生成的细胞团,从而实现了细胞团的回收。AO/PI染色分析及细胞重培养试验证明了回收获得的细胞团内的细胞具有高活力。通过环氧树脂包裹在不同浓度的海藻酸钠和Ca Cl2中形成的海藻酸钙凝胶微球,制成半薄切片,利用亚甲基蓝染色对凝胶微球的内部结构进行了可视化观察。结果表明:海藻酸钙凝胶微球内部空腔形状和大小与在其中生成的细胞团的形状和大小相类似。证明了不同形状的细胞团的形成机制是由于细胞在生长过程中受海藻酸钙凝胶微球内部空腔结构的制约进行增殖和融合。