狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)引起的一种古老的、感染中枢神经系统的急性接触性人兽共患传染病。近年来,我国年均报告的人狂犬病死亡人数仍处高位,特别是动物狂犬病仍呈上升趋势,而目前狂犬病病毒检测方法依然存在诸多不足,因此建立简单快捷、准确特异的狂犬病病毒检测方法十分必要。本研究以纯化的人用狂犬病疫苗毒作为免疫原,通过足垫对6-8周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫,将抗体水平达到融合要求的小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)在PEG作用下进行细胞融合,通过有限稀释法克隆化培养及蛋白免疫印迹、间接免疫荧光试验筛选出3株(1G9,1E6,3F3)能稳定分泌抗狂犬病病毒核蛋白的杂交瘤细胞株,所分泌的抗体亚类都为Ig G2b。用辛酸-硫酸铵法对所收集到腹水进行纯化,纯化后3F3的抗体效价为1.6×104以上。以纯化抗体3F3作为一抗,通过间接免疫荧光对脑组织样品检测,检测发现,其灵敏度和特异性良好。对纯化单抗进行辣根过氧化物酶标记,应用免疫酶染色对病毒感染细胞进行检测,发现其特异性、灵敏度好。建立了多克隆抗体-待检抗原-酶标单抗的双抗夹心ELISA检测RABV方法,并对检测条件进行了优化。抗狂犬病病毒多抗的最佳包被浓度为1:100倍,酶标单抗的最佳稀释浓度为1:1000倍,小牛血清的最佳封闭浓度是10%,最佳封闭时间是2 h,抗原最佳孵育时间为1 h,酶标抗体孵育时间是1 h,底物显色时间是10 min。用已标定效价的狂犬疫苗作为标准品绘制标准曲线,y=1.7012x-0.3596,相关系数为R2=0.9882。对10份细胞培养物样品进行检测,结果发现这10份样品的效价与国外抗狂犬病病毒核蛋白抗体检测结果间无显著差异(P=0.935,P>0.05)。对犬瘟热病毒(CDV),犬细小病毒(CPV)等进行检测,发现本研究所建立的方法具有特异性。