背景：资料显示全球约3.6亿人为乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）携带者，HBV的持续感染会导致慢性肝炎、肝硬化与肝癌等严重后果。核苷酸类似物（nucleotideanalogs；NAs）抗病毒药物的使用是目前抗HBV治疗的有效方法。但由于HBV聚合酶缺乏校正功能，导致其基因突变频率较高，一旦药物作用的靶基因发生变异，NAs药物即失去对病毒复制的抑制作用，从而产生临床耐药现象。目前，HBV耐药基因检测方法主要包括：直接测序法、实时定量多重PCR法、基因芯片法等。但上述方法存在以下不足：①仪器设备要求高：不仅需要PCR仪，同时还须具备DNA测序仪、基因芯片阅读仪等昂贵仪器，中小医疗机构无法满足。②检测时间长，成本高：检测周期从几小时到数天，耗时长，检测成本高，患者经济负担沉重。③操作复杂：对操作人员素质要求较高，且工作量巨大，难以在中小医疗机构常规开展。因此，建立一种简便、快速、准确、成本低廉的HBV耐药基因检测新技术是HBV防治领域急需解决的一个重要问题。锁式探针-滚环扩增（Padlock probe-Rolling circle amplification,PLP-RCA）是近年来发展起来的一种新型核酸扩增技术。PLP由两端识别序列和中间连接序列组成。当两端识别序列和靶序列完全互补杂交时，其末端碱基彼此相邻，在DNA连接酶的作用下，连接成环状DNA分子。环化的PLP恰可作为RCA扩增反应的模板，在引物和聚合酶的作用下进行RCA扩增反应。该技术与其它核酸扩增技术相比，具有高特异性、高灵敏度和操作简易性的独特优势。由于PLP只有在两端识别序列与靶序列完全互补时才能启动RCA扩增反应。因此，PLP具备单碱基差异的识别能力，在耐药位点检测领域独具优势。另外，RCA为恒温扩增，不需昂贵的仪器设备，能有效降低检测成本。因此，PLP-RCA技术具备简便、快速、准确检测HBV耐药基因的独特优势。目的：基于PLP和RCA扩增技术，以HBV替诺福韦（TDF）耐药基因突变位点为研究对象，建立一种简便、快速、准确、成本低廉的HBV耐药基因突变位点检测新方法。方法：1.锁式探针设计：比对近年国内HBV B型流行病毒株基因组序列，筛选适合设计锁式探针的替诺福韦耐药基因突变位点。以其为模板设计HBV野生型PLP探针和引物。同时利用Primer Premier5.0软件预测探针和引物的二级结构。2.建立RCA扩增体系：以合成的含TDF耐药基因突变位点的HBV野生型序列为模板，建立RCA扩增体系，验证所设计探针、模板和引物的有效性。3.RCA扩增体系实验条件优化：分别探讨在35℃、40℃、45℃、50℃和55℃条件下锁式探针与模板杂交对探针连接效率和连接特异性的影响；12U和30U的E.coliDNA连接酶用量对锁式探针连接效率的差异；核酸外切酶Exonuclease I使用与否对RCA扩增特异性的影响。4. RCA扩增检测HBV的TDF耐药突变位点：抽取25例临床乙肝患者血清HBV的全基因组DNA，PCR方法扩增TDF耐药突变位点所在的HBV基因组RT区。PCR产物用RCA方法进行TDF耐药突变位点检测，同时对PCR产物进行测序，检测结果与测序结果比较，验证检测方法的准确率及可行性。并用不同浓度的HBV野生型和突变型人工合成序列为模板，探讨RCA方法的最低检测限和检测特异性。5.建立双循环RCA技术：第一轮RCA扩增产物用限制性核酸内切酶HpaI酶切成PLP探针长度的核苷酸片段，以酶切产物为模板，启动新一轮RCA扩增反应，建立双循环RCA技术。以不同浓度的HBV野生型和突变型人工合成序列为模板，探讨双循环RCA方法的最低检测限和检测特异性。结果:1. Clustal X2软件比对结果显示，HBVTDF耐药位点所在区域基因序列基因最为保守，适合设计padlock探针。针对TDF耐药位点设计的PLP经Primer Premier5.0预测，PLP及其引物无二级结构，环化连接后PLP的二级结构也极少，保证了PLP与模板识别的高特异性和RCA扩增的高效率。2.以合成的TDF耐药基因突变位点的HBV野生型和突变型序列为模板，建立RCA扩增体系，RCA扩增产物电泳结果显示，野生型序列有清晰的电泳条带，突变型序列无RCA扩增产物电泳条带，表明实验设计的PLP探针能有效、特异识别TDF耐药基因突变位点，可用于HBV耐药基因突变位点的检测。3.在PLP环化连接反应中，PLP与HBV的DNA模板杂交温度为45℃时，探针的环化连接效率最高、特异性最好；E.coli DNA连接酶用量为12U和30U时，其环化连接产量基本无显著差异。从检测成本考虑，连接酶用量为12U即可满足实验需要。PLP环化连接产物不用核酸外切酶Exonuclease I消化，突变型模板检测可出现非特异性RCA扩增产物，使用核酸外切酶能消化去除未连接成环的PLP，可有效提高检测的特异性。4.RCA法检测25例乙肝患者HBV样本，检测结果均为阴性，即均未发生TDF耐药突变，与测序结果完全一致，检测准确率达100%。RCA法检测不同浓度的TDF耐药基因野生型和突变型合成模板，RCA方法的最低检测限为50pM，突变型模板检测均无非特异性PLP连接产物及RCA扩增产物，检测的特异性强，能准确区分单个碱基的差异。5.用限制性核酸内切酶HpaI酶切第一轮RCA扩增产物，以酶切产物为模板，建立双循环RCA扩增技术，其检测限为5pM，检测灵敏度较单次RCA扩增法提高10倍；双循环RCA方法检测突变型模板时，均未见RCA扩增产物，检测特异性高。结论：1.设计了检测HBV替诺福韦耐药基因突变位点的锁式探针，成功建立并优化了RCA扩增反应体系，该方法检测特异性强，检测限较高，可应用于HBV耐药基因突变位点的检测。2.建立的方法初步应用于乙肝患者HBV替诺福韦耐药基因突变位点的临床检测，检测结果与测序结果符合率高，检测准确率达到100%，是一种简便、快速、准确、成本低廉的HBV耐药基因检测新方法。3.初步建立了双循环RCA扩增技术，成功将RCA检测灵敏度提高了10倍，其检测特异性强，检测成本更加低廉，有望应用于病原微生物耐药基因的快速检测。