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背景:资料显示全球约3.6亿人为乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)携带者,HBV的持续感染会导致慢性肝炎、肝硬化与肝癌等严重后果。核苷酸类似物(nucleotideanalogs;NAs)抗病毒药物的使用是目前抗HBV治疗的有效方法。但由于HBV聚合酶缺乏校正功能,导致其基因突变频率较高,一旦药物作用的靶基因发生变异,NAs药物即失去对病毒复制的抑制作用,从而产生临床耐药现象。目前,HBV耐药基因检测方法主要包括:直接测序法、实时定量多重PCR法、基因芯片法等。但上述方法存在以下不足:①仪器设备要求高:不仅需要PCR仪,同时还须具备DNA测序仪、基因芯片阅读仪等昂贵仪器,中小医疗机构无法满足。②检测时间长,成本高:检测周期从几小时到数天,耗时长,检测成本高,患者经济负担沉重。③操作复杂:对操作人员素质要求较高,且工作量巨大,难以在中小医疗机构常规开展。因此,建立一种简便、快速、准确、成本低廉的HBV耐药基因检测新技术是HBV防治领域急需解决的一个重要问题。锁式探针-滚环扩增(Padlock probe-Rolling circle amplification,PLP-RCA)是近年来发展起来的一种新型核酸扩增技术。PLP由两端识别序列和中间连接序列组成。当两端识别序列和靶序列完全互补杂交时,其末端碱基彼此相邻,在DNA连接酶的作用下,连接成环状DNA分子。环化的PLP恰可作为RCA扩增反应的模板,在引物和聚合酶的作用下进行RCA扩增反应。该技术与其它核酸扩增技术相比,具有高特异性、高灵敏度和操作简易性的独特优势。由于PLP只有在两端识别序列与靶序列完全互补时才能启动RCA扩增反应。因此,PLP具备单碱基差异的识别能力,在耐药位点检测领域独具优势。另外,RCA为恒温扩增,不需昂贵的仪器设备,能有效降低检测成本。因此,PLP-RCA技术具备简便、快速、准确检测HBV耐药基因的独特优势。目的:基于PLP和RCA扩增技术,以HBV替诺福韦(TDF)耐药基因突变位点为研究对象,建立一种简便、快速、准确、成本低廉的HBV耐药基因突变位点检测新方法。方法:1.锁式探针设计:比对近年国内HBV B型流行病毒株基因组序列,筛选适合设计锁式探针的替诺福韦耐药基因突变位点。以其为模板设计HBV野生型PLP探针和引物。同时利用Primer Premier5.0软件预测探针和引物的二级结构。2.建立RCA扩增体系:以合成的含TDF耐药基因突变位点的HBV野生型序列为模板,建立RCA扩增体系,验证所设计探针、模板和引物的有效性。3.RCA扩增体系实验条件优化:分别探讨在35℃、40℃、45℃、50℃和55℃条件下锁式探针与模板杂交对探针连接效率和连接特异性的影响;12U和30U的E.coliDNA连接酶用量对锁式探针连接效率的差异;核酸外切酶Exonuclease I使用与否对RCA扩增特异性的影响。4. RCA扩增检测HBV的TDF耐药突变位点:抽取25例临床乙肝患者血清HBV的全基因组DNA,PCR方法扩增TDF耐药突变位点所在的HBV基因组RT区。PCR产物用RCA方法进行TDF耐药突变位点检测,同时对PCR产物进行测序,检测结果与测序结果比较,验证检测方法的准确率及可行性。并用不同浓度的HBV野生型和突变型人工合成序列为模板,探讨RCA方法的最低检测限和检测特异性。5.建立双循环RCA技术:第一轮RCA扩增产物用限制性核酸内切酶HpaI酶切成PLP探针长度的核苷酸片段,以酶切产物为模板,启动新一轮RCA扩增反应,建立双循环RCA技术。以不同浓度的HBV野生型和突变型人工合成序列为模板,探讨双循环RCA方法的最低检测限和检测特异性。结果:1. Clustal X2软件比对结果显示,HBVTDF耐药位点所在区域基因序列基因最为保守,适合设计padlock探针。针对TDF耐药位点设计的PLP经Primer Premier5.0预测,PLP及其引物无二级结构,环化连接后PLP的二级结构也极少,保证了PLP与模板识别的高特异性和RCA扩增的高效率。2.以合成的TDF耐药基因突变位点的HBV野生型和突变型序列为模板,建立RCA扩增体系,RCA扩增产物电泳结果显示,野生型序列有清晰的电泳条带,突变型序列无RCA扩增产物电泳条带,表明实验设计的PLP探针能有效、特异识别TDF耐药基因突变位点,可用于HBV耐药基因突变位点的检测。3.在PLP环化连接反应中,PLP与HBV的DNA模板杂交温度为45℃时,探针的环化连接效率最高、特异性最好;E.coli DNA连接酶用量为12U和30U时,其环化连接产量基本无显著差异。从检测成本考虑,连接酶用量为12U即可满足实验需要。PLP环化连接产物不用核酸外切酶Exonuclease I消化,突变型模板检测可出现非特异性RCA扩增产物,使用核酸外切酶能消化去除未连接成环的PLP,可有效提高检测的特异性。4.RCA法检测25例乙肝患者HBV样本,检测结果均为阴性,即均未发生TDF耐药突变,与测序结果完全一致,检测准确率达100%。RCA法检测不同浓度的TDF耐药基因野生型和突变型合成模板,RCA方法的最低检测限为50pM,突变型模板检测均无非特异性PLP连接产物及RCA扩增产物,检测的特异性强,能准确区分单个碱基的差异。5.用限制性核酸内切酶HpaI酶切第一轮RCA扩增产物,以酶切产物为模板,建立双循环RCA扩增技术,其检测限为5pM,检测灵敏度较单次RCA扩增法提高10倍;双循环RCA方法检测突变型模板时,均未见RCA扩增产物,检测特异性高。结论:1.设计了检测HBV替诺福韦耐药基因突变位点的锁式探针,成功建立并优化了RCA扩增反应体系,该方法检测特异性强,检测限较高,可应用于HBV耐药基因突变位点的检测。2.建立的方法初步应用于乙肝患者HBV替诺福韦耐药基因突变位点的临床检测,检测结果与测序结果符合率高,检测准确率达到100%,是一种简便、快速、准确、成本低廉的HBV耐药基因检测新方法。3.初步建立了双循环RCA扩增技术,成功将RCA检测灵敏度提高了10倍,其检测特异性强,检测成本更加低廉,有望应用于病原微生物耐药基因的快速检测。