近视是常见的眼科疾病，患病率高达25％～30％，可引起严重的并发症，在世界各地占致盲眼病第4～7位，其严重性使得近视的研究与防治已成为全球关注的热点。随着近20年来近视动物模型的建立及方法的日趋完善，人们对近视的病因及其特点已有所了解，但对其产生的机制仍所知甚少。最近，我们成功建立了提前光照近视动物模型，并发现视网膜基因表达谱有明显改变，如表皮生长因子(EGF)表达量明显上调、碱性成纤维生长因子(bFGF)的表达则明显下调等。EGF和bFGF是体内两种重要的细胞因子，它们能调控生物体内多种细胞的增殖、分化。本课题将通过建立大鼠巩膜成纤维细胞的体外培养方法，并研究EGF和bFGF对体外培养成纤维细胞生长的影响，探讨EGF、bFGF在巩膜生长、发育及重塑过程中可能的作用，为进一步了解近视发生的分子机制提供依据。 一、研究方法及内容 1、植块法原代培养大鼠巩膜成纤维细胞，用波形蛋白鉴定培养的细胞及其纯度。观察细胞的生长活力，并探讨体外培养的巩膜成纤维细胞的生物学特性。 2、提取出生当天(P0)、出生后14天(P14)、一月龄(P30)、成年、老年大鼠巩膜组织总RNA，用RT-PCR方法对EGF、bFGF进行检测。选取P0、P14、P30、成年和老年大鼠巩膜冰冻切片进行EGFR、FGFRl间接免疫荧光染色。检测体外培养大鼠巩膜成纤维细胞上EGFR、FGFRl的表达。探讨EGF、bFGF与巩膜生长发育的关系。 3、培养第3～4代巩膜成纤维细胞，加入不同浓度的EGF(0．1～200ng／mL)、bFGF(0．1～50ng／mL)，分别培养24、48、72h后用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的增殖密度。观察不同浓度、时间下细胞增殖情况。观察EGF、bFGF对巩膜成纤维细胞增殖的影响，探讨EGF、bFGF在近视发生发展过程中的作用及可能的分子机制。 二、研究结果 1、原代培养的细胞在培养2～3d后可从组织块边缘爬出，细胞呈长梭形，核圆，居中，有少量的细胞突起，细胞大小均匀。10d左右细胞长满融合成单层细胞，以后每隔3～4d可传代。间接免疫荧光结果显示，第2～3代培养的细胞中95％以上表达波形蛋白，表明培养的细胞为巩膜成纤维细胞，且细胞已基本纯化。 2、RT-PCR的结果显示：在P14、P30、成年、老年大鼠巩膜组织中均有明显的EGFmRNA的表达，而Po大鼠巩膜组织中，EGFmRNA表达不明显。在P0、P14、P30、成年大鼠巩膜组织中均有明显的bFGFmRNA的表达，而在老年大鼠巩膜组织中，bFGFmRNA表达不明显。 3、免疫组化结果显示：免疫荧光染色显示各年龄段大鼠巩膜呈现特异性的绿色荧光表达，荧光主要表达在成纤维细胞上，表明EGFR、FGFR!在各年龄段大鼠巩膜组织中呈阳性表达。免疫细胞化学结果显示，在体外培养的巩膜成纤维细胞表面和胞浆有棕褐色着色，细胞核周浓集着色，表明巩膜成纤维细胞上有EGFR、FGFRl表达。 4、细胞增殖实验结果显示：浓度为0．1～100ng／mL的EGF在培养24、48、72h时，对巩膜成纤维细胞有明显的促生长作用，其最佳浓度为1ng／mL。当EGF浓度高于1ng／mL时，EGF的浓度越高，其促增殖作用越不明显。浓度为0．5～50ng／mL的bFGF在培养24、48、72h时，对巩膜成纤维细胞有明显促增殖作用，其最佳浓度为10ng／mL。当bFGF的浓度低于10ng／mL时，bFGF的浓度越低，其促增殖作用越不明显。 三、结论 1、成功培养了巩膜成纤维细胞，为研究巩膜在近视发生发展过程中的作用及自身改变提供了一个有利的研究工具。 2、实验证实巩膜组织中有EGF、bFGF及其相应受体EGFR、FGFRl的表达，在体外培养的巩膜成纤维细胞中亦有EGFR、FGFRl的表达，表明巩膜是EGF、bFGF作用的一个靶位点。 3、一定浓度的EGF、bFGF对大鼠巩膜成纤维细胞均有明显的促增殖作用，且呈剂量相关性。EGF、bFGF可能通过与巩膜成纤维细胞上的相应受体结合，激活受体胞内段酪氨酸蛋白激酶，从而影响细胞的增殖，同时可能直接或间接调控细胞外基质的合成与分泌，表现为巩膜的主动生长和重新塑形，进而引起近视的发生发展。