肝脏是脂类合成代谢和分解代谢的中心器官。正常情况下，肝脏内总脂肪含量占肝脏重量的4％～5％，大约是60～80克，其中半数以上为磷脂，中性脂肪甘油三酯和脂肪酸含量很少。如果肝脏内脂肪的分解与合成代谢失去平衡，或运出发生障碍，脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)就会在肝细胞内过量积聚。 不同病因引起肝脏脂肪积聚的机理各异，一般认为，进入肝脏的脂肪酸过多、肝内形成的甘油三酯增多或氧化减少、脂蛋白的合成减少导致脂肪的运输障碍等是肝脏脂肪积聚的三个基本环节。 肝脏脂肪积聚会引发一系列的严重后果：对肝脏自身的损害，目前在脂肪肝的发病机制中广为接受的是“二次打击学说”，脂肪积聚引起肝脏脂肪变性，形成“第一次打击”，在此状态下更易于受到氧化应激等因素的“第二次打击”，加速肝细胞受损，进展为肝纤维化和肝硬化，甚至肝癌；对肝外器官的损害，非脂细胞内堆积的脂质极易通过非氧化代谢途径产生脂肪中毒，并诱导胰岛素抵抗。因脂质异位相关代谢异常可形成更多反应性脂簇，其典型代表神经酰胺对胰岛β细胞和肝细胞等都有毒性(脂毒性)，而游离脂肪酸可直接抑制胰岛素受体底物-1酪氨酸的磷酸化，造成肝脏和外周IR；对全身的损害，通过加剧代谢紊乱，促进2型糖尿病和动脉粥样硬化的发生，导致代谢综合征相关的肿瘤和心脑血管事件高发，而这些疾病反过来又促进肝脏疾病的进展，增加恶性肿瘤和心脑血管事件的发生。因此，减少肝脏脂肪积聚不但能够直接减轻肝脏损伤，还能够间接改善胰岛素抵抗，减缓代谢综合征的发生和进展。目前，治疗肝脏脂肪积聚的方法主要是针对原发病因，包括运动和饮食疗法等，临床上也有应用药物治疗严重的肝脏脂肪积聚，但是大多具有一定的副作用，因而寻找安全有效的天然化学物质意义重大。 腺苷酸激活蛋白激酶是在肝脏、心脏、骨骼肌中调节能量和代谢平衡的一种蛋白激酶，它广泛存在于真核生物的细胞中，属于丝／苏氨酸蛋白激酶家族成员。当代谢性应激引起细胞内AMP／ATP比值升高时，AMPK发生磷酸化并激活其下游的多种靶分子，减少ATP的消耗和增加ATP的生成，即促进分解代谢；反之，当AMP／ATP比值降低时，AMPK则促进合成代谢。AMPK的这一作用被形象地比喻为“调节细胞能量代谢的开关”，其本身也被称为“细胞能量调节器”。AMPK活化后，可以促进乙酰辅酶A羧化酶磷酸化使其活性降低，减少丙二酰辅酶A合成，从而增强脂肪酸氧化限速酶——肉碱脂酰转移酶-I的活性，促进脂肪酸氧化。由于AMPK控制脂肪酸氧化的细胞信号途径包括AMPK、ACC和CPI-I，又有人称之为“AMPK-ACC-CPT-I信号通路”。除此之外，ACC也是脂肪合成的限速酶，AMPK的活化还能够减少脂肪的合成。因此，AMPK有可能是调节脂肪含量、影响脂质代谢平衡的重要靶点，调节肝脏AMPK有可能会影响肝细胞内的脂肪含量。 大量流行病学资料表明，植物性食物具有广泛的促进健康和预防疾病的作用，这一方面取决于食物中营养素的合理构成，另一方面取决于植物性食物中存在的大量植物化学物。植物化学物的生物学效应已经成为目前营养学研究领域的重要热点之一。花青素是自然界分布最广泛的水溶性植物色素之一，属黄酮类化合物，自然状态下常与各种单糖形成糖苷，称为花色苷，大部分以花和果实为可食部分的植物性膳食中都有不同程度的存在。花色苷最突出的作用就是使植物呈现五彩缤纷的颜色，近年来发现其有很多独特的生理功能，尤其是在抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血管增生及抗突变等方面的生理作用引起了广泛的关注。 研究发现，富含花色苷的食物可以改善高脂诱导的小鼠肥胖，降低ApoE基因缺陷小鼠的血脂水平，减少组织中的脂肪和胆固醇沉积，促进胆固醇外流，抑制CD40诱导的内皮细胞炎症反应。这些结果提示我们，花色苷在防治慢性非传染性疾病方面，可能具有潜在的功效。而本实验室在既往的研究中也发现，黑米花色苷提取物能够显著减少高脂诱导肥胖大鼠的肝脏脂肪积聚，其机制可能与上调肝脏线粒体CPT-I mRNA表达水平有关。 本次研究拟采用HepG2细胞模型，观察花色苷单体矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin 3-O-β-glucoside，Cy-3-g)对AMPK活化、脂肪酸β-氧化和甘油三酯含量的影响，明确花色苷是否能够通过AMPK信号通路调节HepG2细胞脂肪积聚，为花色苷在防治疾病和促进健康方面的研究和应用丰富新的内容。 研究目的： 1.研究花色苷Cy-3-g对HepG2细胞脂肪含量的影响2.探讨花色苷Cy-3-g影响HepG2细胞脂肪积聚的可能机制及其与AMPK的关系研究方法1.细胞培养及分组生长良好的HepG2细胞分别用1μM、10μM、100μM Cy-3-g处理1h；用不加任何干预的细胞作为对照(control)，用1mM的AMPK激动剂AICAR作为阳性对照。 2.花色苷Cy-3-g对HepG2细胞甘油三酯(Triglyceride，TG)含量的影响将HepG2细胞分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集细胞用试剂盒检测。 3花色苷Cy-3-g对HepG2细胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，FAO)的影响将HepG2细胞在无血清1640培养基中饥饿6～8h，用花色苷干预1h，每孔加入3H-棕榈酸2μCi／mL、L-卡尼丁(L—carnitine)1 mmol／L，孵育后吸弃培养基，测定3H2O放射性。 4.花色苷Cy-3-g对HepG2细胞CPT-I水平和ACC磷酸化的影响将HepG2细胞饥饿6～8h后，分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mMAICAR孵育1h，收集细胞总蛋白用于Western blot检测。 5.花色苷Cy-3-g对AMPK活性的影响将HepG2细胞分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集细胞总蛋白，用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)检测AMPK活性。 6.花色苷Cy-3-g对AMPK及其磷酸化水平的影响将HepG2细胞分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和lmM AICAR孵育1h后，收集细胞总蛋白用于Western blot检测。 研究结果： 1.花色苷对HepG2细胞甘油三酯含量的影响与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能显著减少HepG2细胞内的甘油三酯含量(p<0.05)，甘油三酯含量分别减少了8.3％、15.8％、44.1％，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，分别相当于1mMAICAR处理组的43.6％、92.0％和104.4％。 2.花色苷对HepG2细胞脂肪酸氧化的影响与对照组相比，100μM Cy-3-g和1mM AICAR能显著促进HepG2细胞脂肪酸氧化(p<0.01)，脂肪酸氧化水平为对照组的1.2倍，与AMPK激动剂1mMAICAR处理组相当。 3.花色苷对HepG2细胞CPT-I蛋白表达的影响与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能显著促进CPT-I蛋白的表达水平(p<0.001)，CPT-I蛋白表达水平分别为对照组的1.7倍、3.7倍和4.2倍，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mM AICAR处理组的43.6％、92.096和104.4％。 4.花色苷对HepG2细胞ACC磷酸化的影响与对照组相比，10gM、100pM Cy-3-g能显著促进ACC的磷酸化(p<0.001)，ACC磷酸化分别为对照组的3.1倍和4.2倍，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mM AICAR处理组的57.9％和77.7％。 5.花色苷对HepG2细胞AMPK活化的影响与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能显著促进AMPK的活性(p<0.001)，AMPK蛋白活性分别为对照组的1.4倍、3.6倍和5.4倍，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mMAICAR处理组的25.1％、64.4％和97.1％。 6.花色苷对HepG2细胞AMPK磷酸化的影响与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能使显著促进AMPK蛋白磷酸化(p<0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平分别为对照组的1.4倍、2.0倍和3.0倍，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mMAICAR处理组的49.4％、69.5％和103.6％。 7.花色苷对HepG2细胞AMPK蛋白的影响与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR对AMPK蛋白表达水平无影响(p>0.05)。 结论： 1.花色苷Cy-3-g可以减少HepG2细胞脂肪积聚； 2.花色苷Cy-3-g减少HepG2细胞脂肪积聚的机制可能与调节HepG2细胞AMPK-ACC-CPT-1信号通路，促进脂肪酸氧化有关。